脈沖強光誘變選育高產乳酸植物乳桿菌及其益生特性研究

葛善贏，張海濤，王士佳，李佳宸，吳學智，張佰清*

（1.沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧農業職業技術學院，遼寧 營口 115009）

益生菌作為有益微生物（酵母或細菌），在與宿主共生時能給人體帶來有益的保健作用[1]。目前，在發酵食品加工中利用率最廣的益生菌為乳酸菌。乳酸菌是一類革蘭氏染色陽性、無芽孢的菌株，其可以通過發酵糖類而產生大量的乳酸，在自然界中廣泛地存在[2]，是一類應用較早的微生物，主要用于生產發酵食品，賦予產品豐富的滋味和香氣特征，提高其益生性能及抗氧化性能[3-4]。

目前，通過誘變育種來提高乳酸菌菌株的產乳酸能力，常見的誘變技術有紫外誘變、化學試劑誘變、常壓室溫等離子體技術等[5-7]，然而，國內關于利用脈沖強光技術誘變選育高產酸乳酸菌的研究鮮有報道。與其他誘變技術相比，脈沖強光技術作為一種新型誘變技術，具有耗能低、效率高、處理時間短、操作簡單等優點[8-9]。在對枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等菌株中成功運用，可篩選出耐熱、耐酸、耐膽鹽等性能良好的突變株[10-13]。

為進一步提高植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC 6240的產乳酸能力，本研究以其為研究對象，采用脈沖強光進行誘變處理，并以乳酸含量為響應值，通過響應面法優化最佳處理條件。采用最佳脈沖強光對植物乳桿菌CICC 6240進行誘變后，通過溶鈣圈法和乳酸產量測定選育產乳酸能力高的突變株，并對其耐酸、耐膽鹽、人工胃腸液耐受性、疏水性、自聚集能力進行研究，初步探究突變菌株的益生性能，考察脈沖強光作為一種新型的誘變技術應用于植物乳桿菌誘變的可行性，為誘變技術的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC 6240：沈陽農業大學食品學院保藏。

1.1.2 試劑

胃蛋白酶（800 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、碳酸鈣、瓊脂粉、氫氧化鈉：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；無水乳酸鋰、對羥基聯苯、鎢酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈣、濃硫酸、鹽酸、豬膽鹽、二甲苯、氯仿、乙酸乙酯：沈陽伽瑪商貿有限公司；葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸二銨、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、吐溫80：沈陽萊博科貿有限公司。本研究所用試劑均為分析純或生化試劑。

人工胃液：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersaline，PBS）、胃蛋白酶3.0 g/L，鹽酸調節pH至2.5，過0.45 μm濾膜除菌。人工腸液：磷酸鹽緩沖液、胰蛋白酶1.0 g/L，氫氧化鈉調pH至8.0，過0.45 μm濾膜除菌。

1.1.3 培養基

MRS液（固）體培養基：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

QL-10152氙燈管：沈陽農業大學食品學院研制；YX-280A高壓蒸汽滅菌鍋、DK-S22恒溫水浴鍋：常州國華科技有限公司；250Lwi17192恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；2-16KL離心機：美國Sigma公司；Libra S50紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的活化和菌懸液的制備

將保藏于-80 ℃冰箱的植物乳桿菌CICC6240接種于MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h，將菌株活化3次后培養至對數期，8 000 r/min離心10 min，去上清，用0.85%無菌生理鹽水清洗菌體表面3次，采用等體積的0.85%無菌生理鹽水重懸菌體并稀釋106倍制成菌懸液。

1.3.2 脈沖強光誘變條件的確定

取10 mL菌懸液進行脈沖強光照射，在單因素試驗結果（脈沖電壓1 600 V、脈沖次數16次、脈沖距離9 cm）的基礎上，以脈沖電壓（A）、脈沖次數（B）、脈沖距離（C）為考察因素，乳酸產量（Y）為響應值，采用Design-Expert V12.0.3.0設計3因素3水平的Box-Behnken響應面試驗，試驗因素與水平見表1[14-15]。

表1 脈沖強光誘變條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for pulsed light mutagenesis conditions optimization

1.3.3 致死率的計算

取200 μL脈沖強光照射處理后的菌懸液均勻涂布于MRS固體培養基上，37 ℃倒置培養48 h，記錄誘變后菌落數；取200 μL未經脈沖處理菌懸液，相同條件涂布培養，記錄誘變前菌落數，并計算致死率，其計算公式如下：

式中：X為菌株致死率，%；N1為誘變前菌落數，CFU/mL；N2為誘變后菌落數，CFU/mL。

1.3.4 高產乳酸突變菌株的篩選

（1）初篩

取200 μL脈沖強光處理后的細胞懸浮液均勻涂布于含有1.5%碳酸鈣的MRS固體培養基上，37 ℃倒置培養48 h，記錄菌落數，每組做3次平行。測量誘變菌株的溶鈣圈直徑（H）及菌落直徑（C），計算HC值，挑選其中HC值相比于原始菌株HC值大30%的菌株進行復篩[16]。

（2）復篩

將初篩菌株活化后以2%（V/V）的接種量接種到MRS液體培養基中，37 ℃培養14 h，采用對羥基聯苯法測定發酵液乳酸產量[17]，挑選高產乳酸菌株。

1.3.5 益生特性的測定

（1）耐酸能力的測定

將活化3次的菌液以2%（V/V）的接種量接種至pH值分別為2.0、3.0、6.0的MRS液體培養基中，37 ℃培養3 h，試驗重復3次，活菌計數，計算存活率，其計算公式如下：

式中：X為菌株存活率，%；Nt為不同條件下培養后的活菌數，CFU/mL；N為初始活菌數，CFU/mL。

（2）耐人工模擬胃腸液能力的測定

將活化3次的菌液于4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，采用等體積0.85%無菌生理鹽水重懸菌體制備菌懸液。移取1 mL菌懸液于9 mL人工模擬胃液，37 ℃恒溫培養3 h，活菌計數。再取胃液處理后的菌液1 mL接種至9 mL人工模擬腸液，37 ℃培養4 h，活菌計數，并按照公式（2）計算其存活率。

（3）耐膽鹽能力的測定

將活化3次的菌液以2%（V/V）的接種量接種膽鹽含量分別為0.3%、0.5%、1.0%的MRS培養基中，37 ℃恒溫培養3 h，活菌計數，并按照公式（2）計算其存活率。

（4）自凝集性的測定

將1.3.1所制備的菌懸液調整OD600nm值至0.6±0.05，為A0。于37 ℃恒溫培養，在培養0 h、3 h、6 h和24 h時，移取上層培養液，測定OD600nm值，為At，試驗重復3次，計算自凝集率，其計算公式如下：

式中：X為自凝集率，%；A0為培養0 h時的OD600nm值；At為不同培養時間的OD600nm值。

（5）表面疏水性的測定

取2 mL菌懸液分別與2 mL二甲苯、氯仿、乙酸乙酯混合，漩渦振蕩10 min，室溫靜置30 min。取水相測定OD600nm值，重復試驗3次，計算疏水率，其計算公式如下：

式中：X為疏水率，%；A0為試劑萃取前水相的OD600nm值；At為試劑萃取后水相的OD600nm值。

1.3.6 數據處理

每個試驗均平行重復3次，測定結果以“平均值±標準差”表示，使用IBM SPSS Statistics 25.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 脈沖強光誘變條件優化響應面試驗結果

利用Design-Expert V12.0.3.0軟件進行3因素3水平的Box-Behnken響應面試驗，試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表2 脈沖強光誘變條件優化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface tests for pulsed light mutagenesis conditions optimization

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert V12.0.3.0軟件對表2結果進行二次多元回歸擬合，得到多元二次回歸方程：

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型的決定系數R2為0.983 3，校正決定系數R2Adj為0.961 8，表明該模型合理，方程與實際擬合較好，能有效反映出菌株產乳酸與脈沖電壓、脈沖次數和照射距離之間的關系。由表3亦可知，一次項A、C，交互項AC，二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項B對結果影響顯著（P＜0.05），其余項則不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對乳酸產量影響大小順序為A（脈沖電壓）＞C（脈沖距離）＞B（脈沖次數）。

對回歸方程進行最優求解，確定最佳誘變條件為：脈沖電壓1 702.15 V、脈沖次數18.205 4次、脈沖距離9.068 12 cm，在此條件下，乳酸產量預測值為72.7104μg/mL。為便于實際操作，將最優脈沖強光處理條件修訂為：脈沖電壓1 700 V，脈沖次數18次，脈沖距離9 cm。在此條件下重復進行3次試驗，乳酸產量為69.48 μg/mL，與預測值相近，且在此條件下，致死率達到82.56%，說明所建模型擬合條件可行，具有實際參考意義。

2.2 脈沖強光誘變選育

2.2.1 初篩

采用最佳脈沖強光誘變處理植物乳桿菌CICC6240，對高產乳酸菌株進行初篩，結果見圖1。

圖1 高產乳酸突變株的初篩結果Fig.1 Preliminary screening results of mutant strains with high-yield lactic acid

由圖1可知，27株突變菌株的HC值高于原始菌株HC值（2.6），其中，突變菌株G2、G8、G10、G11、G14、G16、G17、G19的HC值較高，為3.5～4.2。因此，對初篩出的8株突變菌株進行復篩。

2.2.2 復篩

初篩突變菌株的乳酸產量見表4。由表4可知，相較于原始菌株的乳酸產量[（48.22±0.61）μg/mL]，突變菌株的產乳酸能力均有顯著提升（P＜0.05）。其中，突變菌株G10和G16的產乳酸能力較強，分別為76.65 μg/mL、75.48 μg/mL，比原始菌株分別提高58.96%和56.53%。因此，選取突變菌株G10和G16為高產乳酸突變株。

2.3 體外益生特性研究

2.3.1 耐酸性試驗

耐酸能力的強弱是評價乳酸菌益生性能的重要指標之一，具有良好的耐酸能力才可以通過胃腸環境且發揮其益生作用，因此，乳酸菌在低pH值下生存是保持胃液環境下存活的條件之一[18-19]，原始菌株和突變株G10、G16的耐酸性見圖2。

圖2 原始菌株與突變株G10和G16的酸耐受性Fig.2 Acid tolerance of original and mutant strains G10 and G16

由圖2可知，在pH值6.0的條件下，3株菌株的存活率均＞90%；在pH值2.0和3.0的條件下，突變株G10、G16的存活率均顯著高于原始菌株（P＜0.05），且突變株G10的存活率顯著高于突變株G16（P＜0.05）。在pH值3.0時培養3 h后，突變株G10、G16的存活率分別為89.30%、82.32%；在pH值2.0時培養3 h后，突變株G10、G16的存活率分別為77.72%、72.55%。

2.3.2 人工模擬胃腸液的耐受性

耐受胃腸液能力是益生菌篩選的另一個重要指標[20]，原始菌株和突變菌株G10、G16的人工模擬胃腸液耐受性見圖3。

圖3 原始菌株與突變株G10和G16的人工模擬胃腸液耐受性Fig.3 Artificial simulated gastrointestinal fluid tolerance of original and mutant strains G10 and G16

由圖3可知，人工模擬胃液處理3 h后，3株菌株的存活率均＞80%，且突變株G10、G16的存活率（89.44%和92.02%）均顯著高于原始菌株（83.14%）（P＜0.05），這與SON S H等[21]研究泡菜中鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamonsus）KCTC 12202BP和布氏乳桿菌（Lactobacillus brevis）G1在同等胃液條件下的存活率（81.28%和87.09%）相似。3株菌株再經人工模擬腸液處理4 h后，活菌數呈下降的趨勢，原因可能是菌株所形成的初始被膜可能會被胃腸液所含有的胃、胰蛋白酶抑制，同時破壞成熟的被膜，導致抑制菌株生長甚至死亡的情況[22]。原始菌株在經人工模擬腸液處理后存活率僅為64.98%，而突變株G10、G16的存活率均維持在70%以上，分別為71.40%、78.16%，顯著高于原始菌株（P＜0.05），表明突變株能夠以較高的活性在腸液環境下存活，這與何宇星等[23]的研究結果相似?？傮w而言，經過脈沖強光誘變的突變株G10和G16具有較強的胃腸液耐受性，在發酵食品中具備一定的應用潛力。

2.3.3 耐膽鹽性試驗

益生菌菌株需要在十二指腸膽鹽中存活，以在腸道發揮其有益作用，促進腸道菌群微生態平衡，被認為是益生菌微生物最重要的特性之一[24-25]。原始菌株和突變菌株G10、G16的膽鹽耐受性見圖4。

圖4 原始菌株與突變株G10和G16的膽鹽耐受性Fig.4 Bile salt tolerance of original and mutant strains G10 and G16

由圖4可知，在0.3%、0.5%的膽鹽條件下，3株菌株的存活率均＞80%，其中突變株G10的存活率最高，分別為92.98%和87.17%，其次為突變株G16，分別為91.85%和84.61%，均高于原始菌株（90.54%和84.00%）。在1.0%的膽鹽條件下，突變株G10的存活率（75.32%）顯著高于原始菌株（62.94%）（P＜0.05），說明其具有良好的膽鹽耐受性。

2.3.4 自凝集能力

細菌的自凝集能力是決定細菌對宿主組織粘附程度的一個重要指標[26]，原始菌株和突變株G10、G16的自凝集能力見圖5。

圖5 原始菌株與突變株G10和G16的自凝集性Fig.5 Autoagglutination of original and mutant strains G10 and G16

由圖5可知，3株菌株于37℃培養3h后，自凝集率在16%～20%；培養6 h后，自凝集率在30%～35%；培養24 h后，自凝集率在70%～80%。其中，突變株G10在培養24 h時具有最高的自凝集率（76.49%），其次為突變株G16（74.80%），均顯著高于原始菌株（70.24%）（P＜0.05）。有研究表明，分離出的乳酸菌孵育4 h時的自凝集率在18%～25%，且隨著孵育時間愈長，自凝集率越高[27]，這與本研究結果一致。

2.3.5 表面疏水性

細胞表面的高疏水性有助于細菌在腸黏膜表面定植，促進細菌與腸上皮細胞的粘附[28]。采用二甲苯（非極性溶劑）、氯仿（單極性，酸性有機溶劑，電子受體）和乙酸乙酯（單極性，堿性有機溶劑，電子供體）檢測原始菌株和突變株G10和G16的表面疏水性，結果見圖6。

圖6 菌株的表面疏水性Fig.6 Surface hydrophobicity of strains

由圖6可知，不同菌株的表面疏水性有顯著差異（P＜0.05），且突變株G10和G16的疏水性顯著高于原始菌株（P＜0.05）。原始菌株和突變株G10、G16對二甲苯（70.30%、83.33%、75.26%）和氯仿（74.16%、78.00%、80.36%）的疏水性均高于對乙酸乙酯的疏水性（47.2%、53.16%、50.36%），表明突變株均具備疏水細胞表面，具有強電子供體。綜上，突變株G10具有良好的表面疏水性。

3 結論

本研究通過單因素試驗及響應面試驗確定植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC 6240的最優脈沖強光誘變條件為脈沖電壓1 700 V，脈沖次數18次，脈沖距離9 cm。在此條件下對植物乳桿菌CICC 6240進行誘變處理，通過鈣透明圈法和乳酸含量測定，篩選得到兩株高產乳酸的突變菌株，分別為G10、G16，其乳酸產量分別為76.65 μg/mL和75.48 μg/mL，比原始菌株分別提高58.96%和56.53%。突變株G10及G16在pH2.0的條件下培養3 h后存活率分別為77.72%和72.55%；在人工模擬胃腸液中培養后，突變株G10、G16的存活率分別為71.40%、78.16%；在1.0%膽鹽條件下培養3 h后，突變株G10及G16的存活率分別為75.32%、62.96%；突變株G10、G16在培養24 h時自凝集率分別為76.49%、74.80%；突變株具有良好的表面疏水性，尤其是突變株G10，其對二甲苯的疏水率為83.33%，對氯仿的疏水率為78.00%，對乙酸乙酯的疏水率為53.16%，說明脈沖強光誘變處理的突變株具有較強的益生特性。綜上，突變株G10為高產乳酸的優良菌株。