《天然藥物化學實驗指導》中黃酮類化合物顯色反應的考證

秦凌月，謝文豪，彭越，韓清娟，黃秀凝，劉艷霞*（.陸軍軍醫(yī)大學藥學與檢驗醫(yī)學系 生藥學與中藥學教研室，重慶 40008；.陸軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院 無軍籍地方生大隊0隊，重慶 40008；.陸軍軍醫(yī)大學藥學與檢驗醫(yī)學系藥物分析與分析化學教研室，重慶 40008）

天然藥物化學是藥學、中藥學專業(yè)的專業(yè)必修課，是運用現(xiàn)代科學理論與方法研究天然藥物中化學成分的一門學科，主要研究天然藥物中各類化學成分的結構特征、物理化學性質(zhì)、提取分離方法、結構鑒定與生物活性、生物合成規(guī)律及途徑、體內(nèi)外動態(tài)變化等[1]。筆者所在教研室承擔藥學四年制本科的天然藥物化學授課任務，理論課56學時、實驗課54學時。實驗課共設置三個實驗，均為18學時，其中實驗二為“堿-酸法提取蘆丁”。

蘆丁（rutin）是糖苷類黃酮的一種，由槲皮素（quercetin）3位上的羥基與蕓香糖（葡萄糖與鼠李糖1-6連接而成的雙糖）脫水而成，超過70種植物或植物來源的糧食中均含有該黃酮，如杏、葡萄、蕎麥種子、櫻桃、洋蔥、李子和橙子等[2]。蘆丁除具有維生素P樣作用外，還具有多種藥理活性，包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗細菌與真菌，廣泛應用于多種疾病的治療[3]。

1 事件概述及原因分析

天然藥物化學實驗課程的選用教材為人民衛(wèi)生出版社的《天然藥物化學實驗指導》（第4版），配套的理論教材為《天然藥物化學》（第7版）[4-5]。在2022—2023學年秋季學期“堿-酸法提取蘆丁”實驗教學中，學生通過堿溶酸沉法從槐米（豆科植物槐Sophorajaponica的花蕾）中提取蘆丁，并依據(jù)其在冷水、熱水中的溶解度差異進行精制；用ZrOCl2/枸櫞酸顯色反應鑒定精制蘆丁時，學生加入2% ZrOCl2/甲醇溶液后溶液顏色變黃，但繼續(xù)加入2%枸櫞酸/甲醇后溶液未發(fā)生褪色現(xiàn)象，與配套理論教材中關于鋯鹽實驗原理的描述（黃酮類化合物分子中有游離的3-OH或5-OH時，3-OH或5-OH、4-酮基與鋯鹽試劑生成黃色鋯絡合物，但3-OH、4-酮基絡合物的穩(wěn)定性較5-OH、4-酮基絡合物強，故加入枸櫞酸后，5-OH黃酮的溶液顯著褪色，而3-OH黃酮仍呈鮮黃色[4]）不相符。超出了學生理解范疇，使學生對該實驗產(chǎn)生了質(zhì)疑。

首先核對試劑，未有異常情況發(fā)生。其次分析原因，ZrOCl2/枸櫞酸反應的溶液未褪色，猜測可能是蘆丁的純度不高，其中含具有3-OH的雜質(zhì)，雜質(zhì)的3-OH、4-酮基與Zr4+形成穩(wěn)定的絡合物，使得加入2%枸櫞酸/甲醇后溶液不褪色。為考證該猜想是否成立，采用師生合作的方式，使用蘆丁（黃酮醇苷，含5-OH）、槲皮素（黃酮醇，含3-OH、5-OH）、芹菜素（黃酮，含5-OH）為對照品（見圖1），對實驗課獲取的精制蘆丁進行鹽酸-鎂粉反應、Molish反應和ZrOCl2/枸櫞酸反應的鑒定，過程中設置試劑用量的梯度以優(yōu)化操作步驟，并使用聚酰胺薄層色譜法鑒定所含雜質(zhì)。

圖1 蘆?。ˋ）、槲皮素（B）、芹菜素（C）的化學結構式Fig 1 Chemical structure of rutin（A），quercetin（B）and apigenin（C）

2 精制蘆丁的顯色反應與薄層色譜

2.1 材料

對照品蘆丁（批號： 153-18-4）、槲皮素（批號： 117-39-5）、芹菜素（批號： 520-36-5）（純度均≥98% ，成都鈉鈳鋰生物科技有限公司），其余試劑均為市售分析純，水為超純水。供試品為“堿-酸法提取蘆丁”實驗課中學生提取并精制的蘆丁樣品。

2.2 供試品及對照品溶液的配制

取供試品16 mg置于25 mL量瓶中，乙醇定容，得供試品待測溶液。

分別取對照品蘆丁16 mg、槲皮素8 mg、芹菜素8 mg置于25 mL量瓶中，乙醇定容，得對應的對照品溶液，分別標記為標液1、標液2、標液3。

2.3 供試品的顯色反應

鹽酸-鎂粉反應：取標液1～3及供試品溶液各2 mL分別放入比色管中，設置梯度用量的鹽酸與鎂粉，即分別加入0.2、0.4、0.2 mL濃鹽酸，再依次分別加入0.03、0.03、0.06 g鎂粉，觀察三組試驗的顏色變化情況。

Molish反應：取標液1～3及供試品溶液各2 mL分別放入比色管中，設置梯度用量的α-萘酚/乙醇溶液，即分別加入0.3、0.2、0.1 mL 10%α-萘酚/乙醇溶液，搖勻，沿管壁滴加3 mL的濃硫酸，觀察三組試驗中兩液面產(chǎn)生的顏色變化。

ZrOCl2/枸櫞酸反應：取標液1～3及供試品溶液各2 mL分別放入比色管中，滴加2%ZrOCl2/甲醇溶液，注意觀察顏色變化情況，至溶液變?yōu)辄S色，繼續(xù)滴加至顏色不再加深為止，記錄消耗的ZrOCl2/甲醇溶液體積；再向試管中加入2%枸櫞酸/甲醇溶液，記錄顏色變化情況。

2.4 供試品的聚酰胺薄層色譜

取聚酰胺薄層板，以標液1～3為對照，點上供試品樣品，用75%乙醇液進行展開。展開一段距離后，吹干，用1% AlCl3溶液對薄層板進行顯色，在日光、紫外燈下觀察樣品斑點的顏色與熒光。

2.5 結果分析

鹽酸-鎂粉反應結果表明，加入0.4 mL濃鹽酸，再加0.03 g鎂粉后顯色較好且鎂粉消化完全，標液1～3及供試品分別呈紅色、淡紅、黃色、紅色。即供試品顯色與對照品蘆丁相同，符合實驗預期，說明實驗課中成功從槐米中提取到蘆?。ㄒ妶D2A）。

圖2 鹽酸-鎂粉反應（A）、Molish反應（B）及ZrOCl2/枸櫞酸反應（C）顯色效果Fig 2 Chromogenic effect of hydrochloric acid-magnesium powder reaction（A），Molish reaction（B）and ZrOCl2/citric acid reaction（C）a.蘆丁對照品（rutin reference）；b.槲皮素對照品（quercetin reference）；c.芹菜素對照品（apigenin reference）；d.供試品（test product）

Molish反應結果表明，加入0.3 mL 10%α-萘酚/乙醇溶液，并滴加3 mL濃硫酸后，標液1、供試品呈現(xiàn)的玫瑰環(huán)明顯，而標液2、3無玫瑰環(huán)現(xiàn)象。符合實驗預期，再次說明實驗課中蘆丁提取成功（見圖2B）。

ZrOCl2/枸櫞酸反應結果表明，消耗1 mL ZrOCl2/甲醇溶液后，標液1～3及供試品溶液均變黃且顏色不再加深；后加入2%枸櫞酸/甲醇溶液，蘆丁與芹菜素標液完全褪色，槲皮素標液不褪色，而供試品發(fā)生褪色但褪色不完全，最終呈現(xiàn)為淺黃色（見圖2C）。這證實了實驗前的推論：“堿-酸法提取蘆丁”實驗課中所用試劑均無異常，供試品不褪色是因為其本身不純、其中含有具3-OH的雜質(zhì)。

聚酰胺薄層色譜的結果表明，供試品的主要成分為蘆丁，但其中含有少量槲皮素（見圖3）。即供試品中具3-OH的雜質(zhì)為槲皮素。

圖3 日光（A）、365 nm紫外光（B）下的薄層色譜圖Fig 3 Thin layer chromatography under sunlight（A）and 365 nm ultraviolet（B）

3 結論與討論

提取的蘆丁中含有槲皮素雜質(zhì)的相關研究，為本實驗的結果提供了有力支撐：孟祥穎等[6]報道通過堿溶酸沉法加熱提取蘆丁，產(chǎn)物常有9%～13%的水解產(chǎn)物存在；趙文斌等[7]從槐米粉提取蘆丁，薄層層析鑒定表明，樣品中含有少量槲皮素；舒曉宏等[8-9]從槐花米中提取蘆丁時發(fā)現(xiàn)，酸堿濃度適宜的石灰水和鹽酸可提高蘆丁產(chǎn)率，但堿提pH值偏高、酸沉pH值偏低，蘆丁粗提率提高的同時帶來含量較高的雜質(zhì)；另有研究者采用有機溶劑提取法，從槐米、苦蕎中提取到的蘆丁，也均被不同程度地分解為槲皮素[10-11]。筆者查閱資料推斷，槲皮素雜質(zhì)是蘆丁在提取過程中被堿水解而產(chǎn)生的：蘆丁的苷鍵為烯醇苷鍵，對堿不穩(wěn)定，堿溶液會催化苷鍵水解[4]；《天然藥物化學實驗指導》中描述“稱取槐花米20 g，取1～1.5 g石灰粉加入10 mL水后研成乳液，槐米在攪拌條件下加入石灰乳，調(diào)節(jié)pH至8～9，加熱至微沸，維持pH 保持40 min……[5]”；在上述提取過程中，用石灰乳調(diào)節(jié)溶液pH使呈堿性，加熱情況符合蘆丁堿水解的條件，故而部分蘆丁堿水解生成槲皮素，造成提取的供試品蘆丁不純。

綜合上述，“堿-酸法提取蘆丁”實驗課中，通過堿溶酸沉法提取蘆丁時，蘆丁發(fā)生部分堿水解生成槲皮素雜質(zhì)，槲皮素含有的3-OH、 4-酮基與鋯鹽試劑形成穩(wěn)定性強的絡合物，故采用ZrOCl2/枸櫞酸反應鑒定蘆丁供試品時，加入2%枸櫞酸/甲醇溶液后，黃色不褪或褪色不完全；而純凈蘆丁的 5-OH 與鋯鹽試劑形成絡合物的穩(wěn)定性較差，采用ZrOCl2/枸櫞酸反應鑒定時，完全褪色?？偠灾?，實驗過程中出現(xiàn)不褪色現(xiàn)象實為蘆丁堿水解生成了槲皮素雜質(zhì)所致，在后續(xù)實驗授課中可給予解釋或進行進一步探討。

此外，本次實驗探究充分體現(xiàn)了基于問題導向（problem-based learning，PBL）[12]的師生合作教學模式，凸顯了“以教師為主導、學生為主體”的教學理念。具體來講，學生在“堿-酸法提取蘆丁”實驗課中發(fā)現(xiàn)了精制蘆丁的ZrOCl2/枸櫞酸反應的不褪色現(xiàn)象；以兩名學生為代表形成學習小組，探討該問題的可能原因，具有天然藥物化學、藥物分析學學科背景的教師成立教學組；師生就該問題交流探討，共同設計用于考證該問題的實驗步驟；學生進行實驗操作，教師指導實驗、答疑解惑；最終師生合作解決了天然藥物化學實驗教學中的問題。教師在指導學生中獲得了成長，學生深刻理解了黃酮化合物顯色反應的原理，實驗操作得以進一步規(guī)范，科研思維也得到引導與培養(yǎng)?；赑BL的師生合作教學模式為深化天然藥物化學課程改革[13]提供了思路與方法。