頂空氣相色譜和頂空氣相色譜-質(zhì)譜法測定20種中藥材中磷化鋁的殘留量

王月玲，戚鵬飛，吳福祥，邵長春，徐雪梅*，楊金草（1.蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，蘭州 70050；2.國家市場監(jiān)管重點實驗室（食品中農(nóng)藥獸藥殘留監(jiān)控），蘭州 70050；.甘南藏族自治州藥品檢驗檢測中心，甘肅 合作 747000）

磷化鋁是國內(nèi)外糧食貯藏中普遍使用的高效殺蟲劑，遇水或酸可產(chǎn)生磷化氫氣體，該氣體是殺蟲的有效成分，其穿透性強，易揮散，且對霉菌也有抑制作用[1]。近年來，藥材市場上廣泛采用磷化鋁熏蒸來代替硫磺熏蒸藥材應(yīng)用于中藥材貯存[2-4]，經(jīng)過磷化鋁熏蒸處理的中藥材可防蟲5～6個月[5]。本課題組前期市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，市場上普遍存在磷化鋁熏蒸中藥材的情況，尤其是從每年的春季驚蟄至秋季寒露期間，熏蒸尤為普遍，在甘肅省地產(chǎn)大宗中藥材中，以黨參熏蒸最甚，黃芪、當歸次之。

然而熏蒸產(chǎn)生的磷化氫屬于劇毒易燃氣體，在熏蒸過程中如處理不當會造成較為嚴重的后果，一般會引起以神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)損害為主的全身性疾病[6]，嚴重的會導致心、肝、腎等重要器官衰竭等[7-8]。熏蒸后磷化氫氣體還容易殘留在藥材中，其安全性尚缺乏系統(tǒng)的研究。目前，中藥材中尚無直接檢測磷化鋁的方法，磷化氫的檢測方法也較匱乏和落后，主要有鉬藍比色法、滴定法、離子色譜法等[9-11]，這些方法的前處理操作均較復雜，方法穩(wěn)定性差，靈敏度較低，專屬性不強，易造成假陽性結(jié)果[12]，并且需要較大的取樣量。近年來，頂空氣相色譜法廣泛應(yīng)用于食品[13-14]、藥品[15-17]、化妝品[18]等樣品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機物的分析，也應(yīng)用于煙草、水果等基質(zhì)中磷化氫的檢測[19-22]，相比傳統(tǒng)磷化氫檢測方法，該法具有前處理簡單、靈敏度高的優(yōu)勢，但目前該方法對中藥材中磷化鋁殘留方面的研究十分有限[23-24]。因此，本試驗選擇甘肅省市售中藥材、中藥飲片中易生蟲的品種（其中包括部分甘肅省地產(chǎn)中藥材品種）黨參、大黃、黃芪、桔梗、枸杞子、款冬花、當歸、杏仁、澤瀉、白芷、土鱉蟲、柏子仁、皂角、肉蓯蓉、桑白皮、天花粉、防己、瓜蔞、酸棗仁、板藍根作為研究對象，采用頂空氣相色譜（HSGC）和頂空氣相色譜-質(zhì)譜（HSGCMS）法建立此20種中藥材、中藥飲片中磷化鋁殘留量的檢測方法，并通過對樣品中磷化鋁的殘留量進行風險評估，為科學評價中藥材的安全性提供數(shù)據(jù)參考，為中藥材市場監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

島津GC-2010 Plus氣相色譜儀（日本島津），配置火焰光度檢測器（FPD）和頂空進樣系統(tǒng)（DANI HSS 86.50 Plus）；安捷倫7890B-7000D（GS-MS）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置安捷倫7697A頂空進樣器，Agilent HP-PLOT/Q-PT毛細管柱（30 m×0.53 mm，40 μm）（美國安捷倫）；MettlerToledo ME403型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；Vortexer 渦旋混勻儀（上海嘉鵬科技有限公司）；10、1000、5000 μL魯爾頭閥門型氣體密封針（上海玻利鴿有限公司）；帶密封翻蓋橡膠塞的600 mL玻璃瓶（徐州榮昌玻璃制品有限公司）；20 mL頂空鉗口樣品瓶及其PTFE硅膠墊瓶蓋（安捷倫）；封口均質(zhì)袋（比克曼生物科技有限公司）。

1.2 試藥

56%磷化鋁（濟南天邦化工有限公司）；硫酸（純度：98%，分析純，重慶川東化工有限公司）；純化水（Milli-Q 超純水儀自制）；其余試劑均為分析純。

中藥材、中藥飲片在甘肅蘭州、定西及安徽亳州藥材市場購買，共20個品種252批次，具體信息見表 1，樣品均經(jīng)蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院戚鵬飛主管藥師鑒定為正品。

表1 樣品收集信息表Tab 1 Sample collection information table

2 方法與結(jié)果

2.1 定量分析

2.1.1 氣相色譜法分離條件 島津GC-2010 Plus氣相色譜儀配置火焰光度檢測器、磷濾光片、Agilent HP-PLOT/Q-PT毛細管柱（30 m×0.53 mm，40 μm）；檢測器溫度250℃；升溫程序為初始50℃保持10 min，升至200℃保持2 min；進樣口溫度220℃，分流進樣，分流比10∶1；載氣：高純氮30 mL·min-1，氫氣 62.5 mL·min-1，空氣90 mL·min-1，柱流量 2 mL·min-1。頂空進樣器條件：氣相循環(huán)時間20 min，頂空瓶平衡溫度50℃，平衡時間10 min，采用振蕩模式。

2.1.2 標準曲線 磷化氫標準貯備氣體的制備：取磷化鋁片1片，稱重為3.232 g，置于600 mL玻璃瓶中，加水10 mL，迅速蓋緊翻蓋橡膠塞密封，室溫下靜置2 d[25]，作為磷化氫標準貯備氣體。用氣體密封針吸取標準貯備氣5.0 mL，注入另一600 mL密封玻璃瓶中，輕輕晃動使混合均勻，作為磷化氫標準原氣。用氣體密封針吸取標準原氣1.0 mL，注入另一600 mL密封玻璃瓶中，輕輕晃動使混合均勻，作為磷化氫標準氣體。

磷化氫標準貯備氣的含量標定：參照SN/T4395—2015中的標定方法[26]，在一個可密封的50 mL試劑瓶中，預先加入10 mL95%的乙醇和20 mL1.5%的氯化汞溶液，吸取5.0 mL磷化氫標準貯備氣注射到此瓶中，充分振搖后，把瓶口倒置約30 s 使其反應(yīng)完全，用甲基紅作指示劑，用氫氧化鈉滴定液（0.05 mol·L-1）滴定至黃色終點（或電位滴定儀滴定），根據(jù)消耗的氫氧化鈉滴定液的體積計算出磷化氫標準貯備氣體的含量。標定數(shù)據(jù)見表2。

表2 磷化氫標準貯備氣及標準氣體含量Tab 2 Content of standard reserve gas and standard gas of phosphine

標準溶液的制備：分別吸取標準氣體0、100、200、500、1000、2000、3000和5000 μL（分別約相當于磷化氫0、0.9976、1.9952、4.9880、9.9760、19.9520、29.9280和49.8800 ng）注入預先加有5.0 mL5%硫酸的20 mL頂空瓶中，渦旋10 s，即得系列對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取供試品粉碎，混勻，精密稱取1 g，置20 mL頂空瓶中，加入5.0 mL 5%硫酸溶液，迅速壓蓋封口，渦旋10 s，即得。

2.1.4 精密度試驗 用氣密針吸取標準磷化氫氣體3000 μL（約相當于磷化氫30 ng），注入預先加有5.0 mL 5%硫酸的20 mL頂空進樣瓶中，平行6份，渦旋10 s，進樣測定，測得磷化氫峰面積RSD為1.3%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項下系列對照品溶液，注入氣相色譜儀測定。以磷化氫質(zhì)量（ng）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝2.496×105X-2.540×105（r＝0.9966），結(jié)果表明磷化氫在1～50 ng內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 專屬性 將未經(jīng)磷化鋁熏制的白芷樣品作為陰性樣品，經(jīng)過熏制的白芷樣品作為陽性樣品，分別取磷化氫標準氣體、陰性樣品、陽性樣品各適量，按“2.1.3”項下方法制備成溶液，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明：陰性樣品溶液色譜圖中未出現(xiàn)與對照品保留時間一致的色譜峰，陽性樣品溶液色譜圖中色譜峰保留時間與對照品一致，且無雜質(zhì)峰干擾。色譜圖見圖1。

圖1 不同溶液的氣相色譜圖Fig 1 Gas chromatograms of different solutions

2.1.7 檢測限與定量限測定 將標準氣體逐步稀釋，根據(jù)磷化氫色譜峰信噪比為S/N≈10，計算該方法的定量限為0.9976 μg·kg-1；S/N≈3時計算該方法檢測限為0.0665 μg·kg-1。

2.1.8 加樣回收試驗 取白芷樣品粉末，稱取約0.5 g，置20 mL頂空瓶中，加入5.0 mL5%硫酸溶液，迅速壓蓋封口，分別加入200、300、500μL的磷化氫標準氣體，每個質(zhì)量濃度平行3份，渦旋10 s，進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，低、中、高濃度平均加樣回收率分別為88.9%（RSD＝6.2%）、84.8%（RSD＝1.5%）、82.3%（RSD＝2.1%）。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 取經(jīng)磷化鋁熏制的白芷樣品，按“2.1.3”項下方法制備成供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h進樣測定，測得磷化氫峰面積RSD為1.3%，表明溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.10 重復性試驗 取經(jīng)磷化鋁熏制的白芷樣品，按“2.1.3”項下方法制備6 份供試品溶液，進樣測定，結(jié)果磷化氫平均含量為0.056 mg·kg-1，RSD為3.8%。

2.2 定性分析

2.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件 安捷倫7890B-7000D（GS-MS）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置安捷倫7697A頂空進樣器、Agilent HP-PLOT/Q-PT毛細管柱（30 m×0.53 mm，40 μm）；色譜柱升溫程序：50℃保持5 min，以50℃·min-1速率升溫至200℃，保持2 min；進樣口溫度：200℃；傳輸線溫度：200℃；載氣：氦氣；進樣方式：分流進樣，分流比：10∶1；電子轟擊能量：70 eV；離子源溫度：200℃；倍增器電壓：自動調(diào)諧值；柱流量：1.0 mL·min-1；質(zhì)量掃描范圍：19～80 amu；掃描方式：離子監(jiān)測掃描SIM，檢測離子：m/z31、33、34。

頂空進樣器條件：加熱箱溫度50℃，定量環(huán)溫度95℃，傳輸線溫度105℃，氣相循環(huán)時間20 min，進樣瓶加熱平衡時間10 min，加壓時間0.2 min，定量環(huán)充滿時間0.2 min，定量環(huán)平衡時間0.2 min，進樣時間1.0 min。

2.2.2 對照品溶液的制備 用氣體密封針吸取標準貯備氣0.2 mL，注入預先加有5.0 mL5%硫酸的20 mL頂空瓶中，渦旋10 s，即得系列對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 同“2.1.3”項下供試品溶液的制備方法。

2.2.4 檢測限的測定 將標準氣體逐步稀釋，直到磷化氫色譜峰信噪比為S/N≈3時，計算出該方法的檢測限為0.0023 μg·g-1。

2.3 樣品的測定和檢測結(jié)果判定

將檢出磷化鋁的陽性樣品按“2.2.1”項下方法進樣測定。

定量分析采用外標法計算磷化氫含量，為保證檢測結(jié)果的可靠性，平行測定2份，并計算相對偏差。如果平行樣相對偏差≤20%，則認為定量數(shù)據(jù)可靠，其含量按2份檢材的平均值計算。如果平行樣相對偏差＞20%，則認為定量數(shù)據(jù)不可靠，應(yīng)重新檢驗。樣品中磷化鋁殘留量檢測數(shù)據(jù)見表3。

表3 中藥材、中藥飲片樣品中磷化鋁殘留量檢測數(shù)據(jù)Tab 3 Aluminum phosphide residues in samples of Chinese medicinal materials and Chinese herbal slices

定性分析中，m/z選擇31、33、34作為監(jiān)測離子，34的響應(yīng)值相對比較高，因此選擇34作為特征離子豐度比參考離子。在相同條件下進行樣品測定時，樣品中磷化氫的色譜峰保留時間與標準溶液一致，且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，磷化氫的質(zhì)譜特征離子與標準溶液一致，特征離子豐度比與濃度接近的標準溶液相比，相對偏差不超過表4規(guī)定的范圍，空白樣品無干擾，則可判斷檢材樣品中檢出磷化氫。

表4 特征離子豐度比的最大允許相對偏差范圍Tab 4 Maximum allowable relative deviation of characteristic ion abundance ratio

檢測數(shù)據(jù)顯示，20種中藥材、中藥飲片均有不同程度的磷化鋁殘留檢出。其中，土鱉蟲中的檢出率最高，達到100%；黃芪、款冬花、黨參、瓜蔞、防己、肉蓯蓉、當歸、桑白皮、杏仁次之，檢出率達50% 以上，天花粉、白芷等淀粉含量高的樣品檢出率較低。

基于殘留量數(shù)據(jù)分析可見，殘留量最高的是當歸，最大達到0.4623 mg·kg-1；黃芪次之，最大殘留量為0.0774 mg·kg-1；土鱉蟲、桔梗、杏仁較低。由此可見，中藥材部分品種中磷化鋁殘留量高于中國食品安全國家標準GB 2763—2021食品中農(nóng)藥最大殘留量國家限量標準中規(guī)定中谷物、油料和油脂、蔬菜中磷化鋁殘留量限度0.05 mg·kg-1，也高于歐洲議會和理事會規(guī)定的國際糧食限量標準（0.01 mg·kg-1）及國際食品法典委員會針對干制蔬菜、干制水果、香料等中磷化氫殘留量的限量標準（0.01 mg·kg-1）。

3 討論

3.1 試驗方法設(shè)計

試驗采用氣相色譜法-火焰光度檢測器（GSFPD-P）定量、氣相色譜-質(zhì)譜法（GS-MS）定性的設(shè)計，主要是由于GS-FPD-P對含磷化合物有高選擇性、高靈敏度，而磷化鋁殘留量是一個痕量檢測，因此選擇GS-FPD-P定量更為適宜。然而中藥材種類繁多，成分復雜，GS-FPD-P在定性方面會受其他一些含磷揮發(fā)性成分的干擾，因此，選擇GS-MS對陽性樣品進一步確認。

3.2 磷化鋁標準氣體的含量標定

參照SN/T 4395—2015對磷化鋁標準氣體含量進行標定，用甲基紅作指示劑，溶液顏色由橙色變?yōu)辄S色。在實際操作中，由于橙色與黃色顏色比較接近，目測觀察顏色突躍有一定困難，影響終點判定，因此建議采用電位滴定法。

3.3 色譜柱的考察

在氣相色譜分析中，為達到理想的分離效果，考察了4種色譜柱，分別是安捷倫HP-5氣相色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、HP-PLOT/Q-PT 色譜柱（30 m×0.53 mm，40 μm）、DB-1701色譜柱（30 m×030 m×0.32 mm，0.25 μm）和島津Rtx-624色譜柱（30 m×0.25 mm，1.40 μm）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除HP-PLOT/Q-PT柱外，其他3種色譜柱對磷化氫均無保留，出峰時間均在3 min以內(nèi)，且峰形存在不同程度的分叉；HP-PLOT/Q-PT柱出峰時間約在8 min左右，峰形光滑對稱，理論板數(shù)高，滿足分析方法需求。

3.4 影響穩(wěn)定性因素

在穩(wěn)定性試驗中，溶液在10 h內(nèi)濃度基本穩(wěn)定，10 h后逐漸減小，分析原因可能是由于磷化氫化學性質(zhì)活潑，能與氧氣發(fā)生反應(yīng)所致。在檢測中建議供試品溶液在10 h內(nèi)進樣。

4 結(jié)論

本試驗建立了HSGC和HSGCMS法測定20種中藥材中磷化鋁殘留量的方法，該方法操作簡便，靈敏度高，專屬性好，適用于中藥材、中藥飲片中殘留的磷化鋁的檢測。