HPLC-ELSD法和UPLC-MS/MS法評價石斛夜光丸中人參投料摻偽情況

朱韜，何頌華，李麗莉，羅軼（廣西壯族自治區食品藥品檢驗所 國家藥品監督管理局中藥材質量監測與評價重點實驗室，南寧 530021）

石斛夜光丸是治療眼疾的古老傳統名方，處方由石斛、人參、山藥、茯苓、地黃、天冬、山羊角等25味中藥組成，現收載于《中國藥典》2020 年版，具有滋陰補腎、清肝明目的功效[1]。現代臨床研究表明，石斛夜光丸用于治療干眼癥、玻璃體混濁、中心性漿液性脈絡膜視網膜病變、慢性葡萄膜炎、青光眼術后、溢淚癥、肝腎陰虧型足跟痛、冠心病及心肌梗死等疾病[2-4]。處方中人參為傘形目五加科人參屬植物人參（PanaxginsengC.A.Mey）的干燥根和根莖，性溫，具有大補元氣、固脫生津、安神益智等功效；西洋參為傘形目五加科人參屬植物西洋參（PanaxquinquefoliumL.）的干燥根，性涼，具有補氣養陰、清熱生津的功效，兩者藥效區別較大，不能混用。

隨著市場需求不斷提升，商家追求高額利潤，近年來不斷有報道使用西洋參混入中藥制劑冒充人參進行投料生產[5-6]。2020年版《中國藥典》中對于石斛夜光丸的人參質量控制僅涉及人參皂苷Rg1和人參皂苷Re兩個成分，但西洋參中也含有這兩種成分[7-8]，單純采用這兩個指標成分進行定性鑒別，對于是否存在西洋參摻偽投料情況無法評判。兩味藥所含化學成分極為相似，均以人參皂苷為重要活性成分，但所含皂苷種類與比例存在一定差異，如西洋參特有的擬人參皂苷F11，人參中基本沒有[5，9]。因此本試驗以擬人參皂苷F11為特征標志物，進行摻偽檢查的方法研究。由于擬人參皂苷F11沒有紫外吸收，本試驗采用了高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD）法，同時通過UPLC-MS/MS技術建立專屬性強的檢查方法，并對收集到的91批樣品進行測試，以期對不同生產企業的產品進行評價，為石斛夜光丸中人參摻偽投料檢測和質量標準完善提供參考。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6460超高效液相色譜-質譜聯用儀（Agilent公司），ELSD 6000蒸發光檢測器（Alltech公司）；XP205電子天平（Mettler Toledo 公司，精度0.01 mg）；Milli-Q純水儀（Millipore公司）。

人參（批號：120917-201712）、西洋參（批號：120997-201810）、擬人參皂苷F11（批號：110841-201607）（中國食品藥品檢定研究院），25批不同產地的西洋參和13批西洋參須均購自市場（經廣西壯族自治區食品藥品檢驗所黃清泉主管中藥師鑒定為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliumL.的干燥根和干燥根須），91批不同廠家、不同批次石斛夜光丸均為2020年國家藥品評價性抽驗樣品。乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC-ELSD法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Capcell PAK C18 MGIII（S-5）（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫（0～20 min：10%→30%A；20～45 min：30%A）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；檢測器ELSD，漂移管溫度105℃，載氣為氮氣，氣體流速3.0 L·min-1，增益1。

2.1.2 溶液的制備

① 對照品溶液：取擬人參皂苷F11（經標定，含量為99.9%）適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含100 μg的溶液，即得。

② 供試品溶液：取本品，研碎，取6 g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液100 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取濾液50 mL，置蒸發皿中，蒸干，殘渣加水25 mL使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取4次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次50 mL，再用正丁醇飽和水50 mL洗滌，分取正丁醇液，減壓濃縮，回收溶劑至干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

③ 陰性樣品溶液的制備：按規定的處方量及工藝自制缺人參的石斛夜光丸陰性樣品，按②項下方法制成陰性樣品溶液。

④ 陽性樣品溶液的制備：取陰性樣品6 g 和西洋參3.4 mg（相當于6 g 制劑中10%人參的處方量），作為陽性樣品，按②項下方法制成陽性樣品溶液。

⑤ 人參供試品溶液的制備：取人參34 mg（相當于6 g制劑中人參的處方量），按②項下方法制成西洋參（須）供試品溶液。

⑥ 西洋參（須）供試品溶液的制備：分別取西洋參和西洋參須各3.4 mg，按②項下方法制成西洋參（須）供試品溶液。

⑦ 摻偽5%西洋參（須）樣品溶液的制備：取陰性樣品6 g 和西洋參（須）1.7 mg（相當于6 g 制劑中5%人參的處方量），作為陽性樣品，按②項下方法制成摻偽樣品溶液。

2.1.3 含量測定 分別精密吸取對照品溶液5 μL、20 μL及供試品溶液10 μL，進樣測定，用外標兩點法對數方程計算擬人參皂苷F11的含量。

2.1.4 專屬性試驗 分別吸取對照品溶液、陰性樣品溶液和對照藥材溶液各10 μL，進樣測定。結果西洋參和西洋參須在擬人參皂苷F11峰相應位置顯示有對應色譜峰，陰性樣品和人參在擬人參皂苷F11相應位置無色譜峰，表明本方法專屬性較好，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC-ELSD法專屬性試驗色譜圖Fig 1 HPLC-ELSD diagram of specific test

2.1.5 線性關系考察 稱取擬人參皂苷F11對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為0.0528、0.1055、0.3165、0.5275、1.0550 mg·mL-1的對照品溶液，進樣測定。以對照品進樣量為橫坐標（X），峰面積對數值為縱坐標（Y）繪制標準曲線，計算回歸方程為：Y＝1.650X+2.315，r＝0.9999。結果表明，擬人參皂苷F11在進樣量為0.528～10.550 μg內與峰面積對數值線性關系良好。

2.1.6 耐用性試驗 考察3種不同品牌色譜柱[CAPCELL PAK C18 MGIII（S-5）（5 μm，4.6 mm×250 mm）、Agilent 5TC-C18（2）（5 μm，4.6 mm×250 mm）、菲羅門SuperLu C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）]，結果3種色譜柱測定人參皂苷F11的峰面積RSD為0.79%，表明方法耐用性良好。

2.1.7 精密度試驗 精密吸取擬人參皂苷F11對照品溶液，連續測定6次，結果峰面積的RSD為1.1%，表明本法的儀器精密度較好。

2.1.8 重復性試驗 取同一批石斛夜光丸供試品（陽性樣品），平行稱取6份，按“2.1.2”項下方法制成相應溶液并測定，結果擬人參皂苷F11平均含量為149 μg·g-1，RSD為0.81%，表明本方法重復性較好。

2.1.9 穩定性試驗 取同一批石斛夜光丸供試品（陽性樣品），按“2.1.2”項下方法的色譜條件，每隔4 h測定一次，共測定6次，結果擬人參皂苷F11峰面積的RSD為1.4%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.10 加樣回收試驗 取陽性供試品6 g，精密稱定，精密加入擬人參皂苷F11對照品溶液（2.4 mg·L-1）100 mL，按“2.1.2”項下方法制成相應溶液并測定，結果加樣回收率為98.7%～104.4%，RSD為2.2%。

2.1.11 定量限和檢測限 精密吸取擬擬人參皂苷F11對照品溶液（1.1 mg·mL-1），逐級稀釋，進樣測定，S/N為3∶1時確定檢測限，S/N為10∶1時確定定量限，結果擬人參皂苷F11的定量限、檢測限分別為13 μg·g-1、5.8 μg·g-1。

2.1.12 限度擬訂 按照2020版《中國藥典》四部0212藥材和飲片檢定通則規定雜質通常不得過3%[10]；中藥成方制劑中人參與西洋參顯微鑒別較困難，故放寬限度，以摻偽5%西洋參（須）樣品中擬人參皂苷F11的含量平均值為限度。

2.1.13 摻偽樣品測定 38份摻偽樣品中擬人參皂苷F11的含量平均值為40 μg·g-1，擬訂限度為石斛夜光丸每1 g含擬人參皂苷F11不得過40 μg。

2.2 UPLC-MS/MS法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相：以0.1%甲酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫，0～6 min：90%A；6～20 min：90%→50%A；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：30℃，進樣量：1 μL。

2.2.2 質譜條件 采用電噴霧電離源，負離子方式掃描，MRM 模式檢測；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：5 L·min-1；霧化氣壓力：40 psi；鞘流氣溫度：350℃；鞘流氣流速：10 L·min-1；毛細管電壓：3 kV；噴嘴電壓：500 V；選擇m/z845.5→653.4和m/z845.5→490.9作為檢測離子對。

2.2.3 溶液的制備

① 對照品溶液：取擬人參皂苷F11對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含2 μg的混合溶液，即得。

② 供試品溶液：精密吸取“2.1.2”項下供試品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得。

2.2.4 專屬性試驗 分別取“2.1.2”項下溶液，精密稀釋10倍，進樣測定。結果陰性樣品和人參色譜中，均未出現與擬人參皂苷F11對照品色譜保留時間相同的色譜峰，表明處方中其他藥味對該測定方法無干擾，見圖2。

圖2 UPLC-MS/MS法專屬性試驗色譜圖Fig 2 UPLC-MS/MS chromatogram of specific test

2.2.5 線性關系考察 精密量取“2.1.2”項下對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、1、2 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻，進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程為：Y＝3.92×104X+3.04×103，r＝0.9998，在0.51～20 μg·mL-1內與峰面積線性關系良好。

2.2.6 耐用性試驗 選取Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent Eclipse C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters CORTECS C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）3種色譜柱，對檢出西洋參摻偽的陽性樣品進樣分析，結果3種色譜柱的分析結果一致，擬人參皂苷F11的峰面積RSD為2.0%，表明方法耐用性良好。

2.2.7 精密度試驗 取擬人參皂苷F11對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，連續進樣6次，測得峰面積的RSD為1.9%，表明該儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 取“2.1.8”項下供試品溶液，稀釋10倍，進樣測定，結果色譜峰面積的RSD為1.7%，結果表明本法重復性較好。

2.2.9 穩定性試驗 取“2.1.9”項下供試品溶液，稀釋10倍，每隔4 h測定一次，共測定6次，結果擬人參皂苷F11峰面積RSD為1.2%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.10 加樣回收試驗 取陽性供試品6 g，精密稱定，精密加入擬人參皂苷F11對照品溶液（2.51 mg·L-1）100 mL，按“2.2.3”項下方法制成相應溶液并測定，結果加樣回收率為98.03%～106.07%，RSD為3.2%。

2.2.11 檢測限和定量限 取未檢出的空白樣品制備空白基質溶液，精密加入擬人參皂苷F11對照品（80 μg·mL-1）0.1 mL，按“2.2.3”項下方法制備，進樣分析，按信噪比S/N≈3折算，擬人參皂苷F11的檢測限為0.6 μg·g-1；按S/N≈10折算，擬人參皂苷F11的定量限為1.9 μg·g-1。

2.2.12 限度擬訂 不同西洋參和西洋參須制成的摻偽樣品，擬人參皂苷F11的峰面積差異較大，因此以5%西洋參摻偽樣品的平均峰面積為擬訂限度的參考。

2.2.13 摻偽樣品測定 38份摻偽樣品的擬人參皂苷F11峰面積平均值為87 398.79，對應對照品的質量濃度為2 μg·mL-1。

2.2.14 判定原則 以擬人參皂苷F11對照品質量濃度（2 μg·mL-1）為判定限度，規定結果判斷標準為：以m/z845.5→653.4和m/z845.5→490.9提取的供試品離子流色譜中，應不得同時出現擬人參皂苷F11保留時間一致的色譜峰；若同時出現，則供試品色譜中m/z845.5→653.4的色譜峰面積值應不得大于對照品溶液中相應的峰面積值。

3 樣品含量測定

對91批石斛夜光丸進行檢測，采用HPLCELSD法，結果35批樣品擬人參皂苷F11含量超出擬訂限度；采用UPLC-MS/MS法檢測，結果35批樣品擬人參皂苷F11質量濃度大于2 μg·mL-1。結果見表1。

表1 石斛夜光丸中擬人參皂苷F11的含量Tab 1 Content of pseudoginsenoside F11 in Shihu Yeguang pills

4 討論

4.1 檢測方法的選擇

本試驗對擬人參皂苷F11的提取方法進行了優化，考察了溶劑回流法和超聲提取法，比較了不同溶劑提取（甲醇、70%甲醇、50%甲醇）、不同溶劑用量（50、100、150 mL）、不同提取時間（45、60、90 min）、洗滌次數對提取的影響，最終選擇了本研究的提取方法。

人參與西洋參的區分方法有薄層色譜和性狀鑒別[11]。本研究前期對薄層色譜方法進行了探索，由于薄層色譜靈敏度低，處方中藥味較多，干擾斑點影響嚴重，不適用于石斛夜光丸中西洋參的檢查。人參在石斛夜光丸中為原粉入藥，因此不能通過性狀進行鑒別。ELSD作為通用型檢測器，可快速完成對無紫外吸收化學成分的定性與定量分析，HPLC-ELSD法減少中藥制劑中紫外吸收強的成分的干擾，特別適用于測定皂苷類成分含量[12-14]。本研究使用的兩種檢測方法，UPLC-MS/MS法專屬性強，分析時間短，而HPLC-ELSD法簡便，儀器檢測成本比較低，均適用于石斛夜光丸中擬人參皂苷F11的檢測。

4.2 擬人參皂苷F11的裂解途徑

擬人參皂苷F11為皂苷類化合物，質譜裂解中主要丟失母核上連接的糖苷碎片，負離子模式下質譜響應較好，顯示較強的[M+HCOO]-m/z845.5的準分子離子峰，母離子峰為m/z799.6 [MH]-，先脫去一分子鼠李糖（rha）得到碎片離子（m/z653.4），再脫去一分子葡萄糖（glc），得到m/z490.9的碎片離子，裂解途徑見圖3。

圖3 擬人參皂苷F11質譜裂解途徑Fig 3 Fragmentation pathway of pseudoginsenoside F11

4.3 評價石斛夜光丸中人參摻偽投料情況

本研究結果顯示，35批石斛夜光丸檢出含有西洋參，不合格率為38.5%，18家生產企業中8家企業樣品檢出擬人參皂苷F11超出限度，可見人參摻偽問題嚴重。中成藥中人參多以粉末入藥，西洋參與人參以粉末入藥時極為相似難以通過外觀進行有效區分，多數中成藥現行標準以人參皂苷Rb1、Re和Rg1作為檢驗指標，西洋參各部位（莖葉、主根、須根、蘆頭、根皮、根心等）均含人參皂苷Rb1、Re和Rg1，僅含量存在差異，以總量計含量大于人參[15-18]。調研發現，西洋參價格與人參相當甚至更高，而西洋參須和西洋參邊角料價格僅為西洋參價格的20%左右。因此，不法商家以西洋參須或西洋參邊角料代替人參投料。

4.4 總結

近年來發現的中成藥人參中西洋參摻偽問題較為嚴重，亟需得到重視。本研究首次建立了HPLCELSD法測定石斛夜光丸中擬人參皂苷F11的含量，同時建立了UPLC-MS/MS法，兩種方法都能夠準確有效地判斷石斛夜光丸中是否有西洋參摻偽投料，為評價石斛夜光丸等含人參中成藥中人參投料情況提供了技術支持。