GC-MS/MS法測定復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中N-亞硝基二甲胺與N-亞硝基二乙胺

岳青陽，張耀文，徐萬魁*（1.遼寧省檢驗檢測認證中心，沈陽 110036；2.遼寧省藥品檢驗檢測院/國家藥品監督管理局化學藥品質量研究與評價重點實驗室，沈陽 110036）

基因毒性雜質是指能夠直接或間接損傷細胞DNA，產生基因突變或體內誘變，具有致癌可能或者傾向的一類物質，對DNA的損害包括染色體斷裂、DNA重組及復制過程中共價鍵的插入和修飾，也包括在細胞水平產生基因毒性物質而產生的突變[1-2]，如磺酸酯類、N-亞硝胺類、鹵代烷烴類和肼類等，其中N-亞硝胺類基因毒性雜質是公認的強毒性的化合物之一。N-亞硝基二甲胺（NDMA）及N-亞硝基二乙胺（NDEA）均為常見的N-亞硝胺類化合物，不僅屬于2A類致癌物質，而且屬于三大“關注隊列”的基因毒性雜質，在 ICH M7 指南中明確該類化合物具有較高致癌性[3-5]。

目前，我國高血糖發病率持續增長，其中2型糖尿病占糖尿病人群的近90%，二甲雙胍產品作為治療2型糖尿病的一線藥物，有著穩定的市場需求[6]。糖尿病患者需要終身服藥，且服用的劑量大、時間長，因此需要更加嚴格地控制雜質水平。2019年12月，FDA宣布從降糖藥物鹽酸二甲雙胍制劑中檢出雜質NDMA，隨后我國藥品監督管理部門也陸續開展了二甲雙胍制劑中NDMA的監測工作[7-9]。復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊為鹽酸二甲雙胍與格列吡嗪的復方制劑，臨床上用于改善2型糖尿病患者的血糖控制，由臨床數據顯示，使用該復方制劑比單獨使用二甲雙胍效果更佳，且患者依從性、耐受性好，因此該制劑在臨床上使用較為廣泛[10-11]。目前復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊在國內尚屬獨家品種，并未對其中的亞硝胺類雜質進行控制，國內未見復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中NDMA和NDEA檢測的有關文獻。本文采用GC-MS/MS法同時測定鹽酸二甲雙胍格列吡嗪膠囊中的NDMA和NDEA，結果準確可靠，可為其質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器

氣相色譜-質譜聯用儀（GC2030氣相色譜儀，TQ8050NX質譜檢測器，日本島津公司）。XP205電子天平（美國METTLER TOLEDO公司，精度0.000 01 g）。

1.2 試藥

NDMA對照品（純度為99.5%，批號：510166-202104）、NDEA對照品（純度為100.0%，批號：510168-202103）（中國食品藥品檢定研究院）。二氯甲烷（色譜純，批號：22085094，美國Fisher公司）；鹽酸（分析純，批號：20210220，國藥集團化學試劑有限公司）；氦氣（純度＞99.99%）。8批復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊均為遼寧修和藥業有限公司生產。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent VF-WAXms毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm）。柱溫為程序升溫：初始溫度為40℃，維持0.5 min后，以20℃·min-1的速率升至200℃，再以60℃·min-1的速率升至240℃，維持5 min；進樣口溫度為250℃；進樣量：1 μL；載氣為氦氣，流速1.2 mL·min-1；電離方式：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：230℃；采集模式：MRM；離子源電壓0.99 kV。NDMA的定量離子對74/44，碰撞能量為6 V，定性離子對為74/42，碰撞能量為21 V；NDEA的定量離子對為102/85，碰撞能量為6 V，定性離子對為102/55，碰撞能量為21 V。

2.2 對照品儲備液的制備

分別取NDMA與NDEA對照品各約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取本品內容物適量（約相當于鹽酸二甲雙胍500 mg），置50 mL離心管中，加1 mol·mL-1鹽酸溶液10 mL，渦旋1 min，再以350 次·min-1的頻率振搖10 min，精密加入二氯甲烷10 mL，以1000 r·min-1渦旋1 min，繼續振搖10 min，然后以4000 r·min-1離心10 min，小心抽取下層二氯甲烷層過濾，以0.45 μm濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 系統適用性試驗

精密量取混合對照品儲備液適量，用二氯甲烷稀釋至質量濃度為40 ng·mL-1的溶液作為系統適用性溶液，以二氯甲烷作為空白溶液，取系統適用性溶液和空白溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，見圖1。結果表明，溶劑不干擾NDMA和NDEA的測定。

圖1 二甲雙胍格列吡嗪膠囊代表性色譜圖Fig 1 Representative chromatogram of compound metformin hydrochloride and glipizide capsules

2.5 線性關系考察

精密量取混合對照品儲備液適量，用二氯甲烷逐步稀釋至0.2、0.5、1、2、5、10、20、40 ng·mL-1，進樣測定，結果見表1。各組分在0.1966～39.32 ng·mL-1及0.1870～37.41 ng·mL-1內與峰面積線性關系良好。

表1 NDMA和NDEA線性關系、檢測限及定量限Tab 1 Linearity，detection limit，and quantitation limit of NDMA and NDEA

2.6 檢測限和定量限

精密量取對照品儲備液，用二氯甲烷逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以信噪比（S/N）≈3時的濃度，為其檢測限（LOD），S/N≈10時的濃度，為其定量限（LOQ），結果見表1。

2.7 精密度

取0.5 ng·mL-1對照品線性溶液，連續進樣6次，記錄色譜圖，NDMA的RSD為1.8%（n＝6），NDEA的RSD為3.2%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.8 加樣回收試驗

取同一批樣品內容物9份，分別精密加入20、25、30 ng·mL-1對照品溶液1 mL，各3份，按“2.3”項下方法進行處理后進樣測定，計算各濃度的回收率。結果NDMA和NDEA加樣回收率在82.3%～85.4%，RSD在2.6%～3.9%，結果表明該方法準確可靠。

2.9 重復性

取樣品4粒內容物，精密加入25 ng·mL-1對照品溶液1 mL，按“2.3”項下方法進行處理后進樣測定，同法配制6份，記錄色譜圖。結果NDMA和NDEA峰面積的RSD分別為2.6%和4.1%，表明重復性良好（n＝6）。

2.10 穩定性

取重復性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12 h進樣測定。結果表明，以二氯甲烷為溶劑，NDMA和NDEA在12 h內穩定，峰面積的RSD分別為2.4%和4.9%。

2.11 測定結果

取本品適量，按“2.3”項下方法處理后進樣測定，將測定結果代入標準曲線計算NDMA和NDEA含量。結果表明，8批復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中均未檢出NDMA和NDEA。

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

目前，N-亞硝胺雜質的定量分析方法主要有GC-MS法、GC-MS/MS法、LC-MS/MS法、LCHRMS法等[12-15]，本文采用GC-MS/MS方法，檢測專屬性強，靈敏度高，操作簡便。

3.2 質譜條件的選擇

制備10 μg·mL-1的混合對照品溶液，使用全掃描模式對混合對照品溶液進行m/z40～200內的掃描，使用譜庫比對確定NDMA和NDEA的色譜峰，根據相對強度選擇前體離子，NDMA和NDEA均選擇分子離子作為前體離子。再通過產物離子掃描對碰撞能量及二級碎片離子進行優化，選擇響應最高的產物離子，作為定性離子和定量離子。

3.3 供試品提取方法的選擇

中國食品藥品檢定研究院頒布的鹽酸二甲雙胍中N-亞硝基二甲胺推薦檢測方法中鹽酸二甲雙胍不同制劑采用了不同提取溶劑，本研究分別考察了二氯甲烷及鹽酸加二氯甲烷兩種提取方式，并考察了渦旋時間及振搖時間等因素。通過NDMA及NDEA的回收率對比試驗，發現采用二氯甲烷提取，基質效應較大，輔料干擾測定，而采用1 mol·mL-1鹽酸加二氯甲烷作為提取溶劑時，輔料不干擾測定，且提取時渦旋1 min，振搖10 min，提取效果最佳。

3.4 假陽性結果的處理

在樣品測定中發現在與NDMA對照品相同保留時間處出現色譜峰，且該色譜峰的定量與定性離子對均與對照品相同，但離子強度比與對照品相差較大，出現了假陽性現象。經優化質譜條件，將分辨率由“high”優化為“unit”后，假陽性現象消失。

根據美國致癌性數據庫（CPDB）中化合物的TD50值，NDMA和NDEA按每日注射最大日暴露量（PDE）96 ng·d-1和26.5 ng·d-1計，按照二甲雙胍每日最大劑量2000 mg，NDMA和NDEA對應的分析評價閾值（AET）為48 ng·g-1和13.25 ng·g-1。通過對8批復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中的NDMA和NDEA雜質進行檢測，結果顯示兩種雜質含量均小于其AET。