超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定除臭類化妝品中烏洛托品及13種喹諾酮類抗菌物質(zhì)

涂曉琴，鐘慧，吳姣嬌，殷帥，黃海萍，潘小紅*（1.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，長(zhǎng)沙 410001；2.湖南省藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410001）

隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展和人們自我關(guān)注的增強(qiáng)，體味的遮蓋和消除越來越受到重視，止汗除臭類化妝品作為個(gè)人衛(wèi)生護(hù)理品市場(chǎng)的三大產(chǎn)品之一，其全球市場(chǎng)銷售額居個(gè)人護(hù)理品的前列[1-2]。研究表明 ，除臭化妝品達(dá)到除臭效果通常有以下兩種方式：① 通過強(qiáng)力的收斂作用來抑制汗液的過度排出，間接除臭；② 抑制微生物對(duì)汗液的降解減少惡臭物質(zhì)的產(chǎn)生[3-4]。除臭產(chǎn)品的熱銷讓商家看到了商機(jī)，為追求利益、達(dá)到良好的除臭效果，不法商家違法在化妝品中添加抗菌藥物類抑菌劑，越來越多的化妝品中被檢出此類違法添加物[5]。

烏洛托品一般作為防腐劑添加到化妝品中，在弱酸性條件下可分解產(chǎn)生甲醛和氨，起到殺菌作用[6]；喹諾酮類物質(zhì)具有良好的抗菌性能，能有效抑制微生物分解汗液來減少不良?xì)馕丁趼逋衅泛袜Z酮類物質(zhì)雖能有效減少臭氣產(chǎn)生，但長(zhǎng)期使用含此類物質(zhì)的化妝品存在安全風(fēng)險(xiǎn)，可引起皮膚過敏、皮炎和濕疹，并伴有奇癢和脫皮等癥狀，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性[7-8]。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）[9]中化妝品準(zhǔn)用防腐劑列表刪除了烏洛托品，且規(guī)定抗菌藥物類藥物不得作為原料或組分添加到化妝品中。2021年1月1日開始施行的《化妝品監(jiān)督管理?xiàng)l例》[10]，除臭化妝品不再作為特殊化妝品，而是作為普通化妝品管理，管理的松懈更是讓不法商家看到可趁之機(jī)，該類化妝品中的非法添加物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)仍然很高。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）[9]僅規(guī)定了依諾沙星等10種組分的檢測(cè)方法，烏洛托品也鮮少有與其他組分同時(shí)測(cè)定的報(bào)道。本文通過優(yōu)化提取溶劑、流動(dòng)相等關(guān)鍵因素，采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測(cè)除臭化妝品中烏洛托品及13種喹諾酮類抗菌藥物（依諾沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、莫西沙星、那氟沙星），并對(duì)市場(chǎng)上不同包裝劑型的除臭化妝品進(jìn)行檢測(cè)，為除臭化妝品的質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-30A超高效液相色譜儀（日本島津公司）；API5500三重四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源（ESI）（美國(guó)AB Science公司）；PM5-2000TD型超聲波清洗儀（英國(guó)PRIMA公司）；Multifuge X1型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermofisher公司）。

1.2 試藥

氯化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸、乙腈、甲酸銨（色譜純，德國(guó)Merck公司）；水為一級(jí)實(shí)驗(yàn)用水。

烏洛托品溶液（批號(hào)：2204556，質(zhì)量濃度：1000 mg·L-1，ANPEL）；雙氟沙星鹽酸鹽（批號(hào)：D0017994，純度：96.6%，BePure）；依諾沙星（批號(hào)：130453-201802，純度：91.5%）、氟羅沙星（批號(hào)：130158-200902，純度：99.2%）、諾氟沙星（批號(hào)：130450-201907，純度：99.6%）、氧氟沙星（批號(hào)：130450-201907，純度：99.5%）、培氟沙星（批號(hào)：130459-201402，純度：71.3%）、環(huán)丙沙星（批號(hào)：130451-201904，純度：83.1%）、洛美沙星（批號(hào)：130452-201603，純度：90.4%）、恩諾沙星（批號(hào)：510117-201501，純度：100%）、鹽酸沙拉沙星（批號(hào)：510118-201501，純度：100%）、司帕沙星（批號(hào)：130461-201502，純度：99.4%）、莫西沙星（批號(hào)：510140-202003，純度：95.6%）、那氟沙星（批號(hào)：130462-201001，純度：97.0%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

樣品來源于隨機(jī)抽取市場(chǎng)和網(wǎng)絡(luò)銷售宣稱具除臭作用的化妝品，共126批，采樣區(qū)域覆蓋省會(huì)城市、地級(jí)市、市縣/區(qū)縣；采樣點(diǎn)涉及網(wǎng)購平臺(tái)、批發(fā)市場(chǎng)、商場(chǎng)及小商店。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基鍵合硅膠質(zhì)譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相：A為5 mmol·L-1甲酸銨溶液，B為乙腈；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：3 μL；梯度洗脫程序設(shè)置見表1。

表1 洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.1.2 質(zhì)譜條件 MS條件：電噴霧離子源；正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（ESI+）；噴霧電壓：4500 eV；離子源溫度：500℃；離子源氣體：50 psi；輔助氣：25 psi；氣簾氣：35 psi；離子駐留時(shí)間：20 ms；相應(yīng)的母離子、子離子、碎裂電壓（DP）和碰撞電壓（CE）等參數(shù)見表2。

表2 14種目標(biāo)化合物質(zhì)譜檢測(cè)條件Tab 2 MS parameters of 14 target compounds

2.2 溶液制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

① 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取烏洛托品、依諾沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、莫西沙星、那氟沙星適量，用乙腈配制成1 g·L-1的各單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4℃條件下保存。

② 混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液：精密移取上述各單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL，置10 mL量瓶中，用50%乙腈定容，搖勻，得10 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4℃條件下保存。

③ 系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：分別精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液適量，用50%乙腈稀釋成10、25、50、75、100、150 ng·mL-1的系列對(duì)照品工作液。

2.2.2 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取化妝品樣品（實(shí)際樣品或空白樣品）0.2 g（精確到0.0001 g），置于10 mL離心管中，準(zhǔn)確加入3 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋30 s，分散均勻，加入乙腈5 mL，渦旋30 s，超聲提取20 min，靜置至室溫，加水定容至刻度，搖勻，以8000 r·min-1離心5 min，濾過[必要時(shí)取上清液適量用50%乙腈稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)，稀釋液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾]后進(jìn)樣測(cè)定。

2.2.3 樣品測(cè)定和結(jié)果計(jì)算 按上述條件測(cè)定加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液，采用特征離子豐度比進(jìn)行定性，根據(jù)表3回歸直線方程定量，按式（1）計(jì)算樣品中目標(biāo)組分的含量。

式中：ω代表樣品中待測(cè)組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg·g-1）；ρ代表從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)組分的質(zhì)量濃度（ng·mL-1）；V代表樣品定容體積（mL）；m-樣品取樣量（g）；D-稀釋倍數(shù)（如未稀釋則為1）。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除分析物以外的其他成分對(duì)待測(cè)物測(cè)定值的影響[11]，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品，盡可能保持樣品中基質(zhì)不變，建立一個(gè)校正曲線，用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值進(jìn)行評(píng)估[12-13]。公式如下：

MF＝Ka/Kb

式中，Ka代表基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；Kb代表溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；MF代表基質(zhì)效應(yīng)，MF＜1表示基質(zhì)抑制；MF＞1表示基質(zhì)增強(qiáng)。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

使用十八烷基鍵合硅膠質(zhì)譜柱，參考該類物質(zhì)的常用流動(dòng)相[9]，水相通常選0.1%甲酸溶液或5 mmol·L-1甲酸銨，有機(jī)相選擇甲醇和乙腈。試驗(yàn)結(jié)果表明，在5 mmol·L-1甲酸銨條件下，目標(biāo)化合物色譜峰響應(yīng)更高，依諾沙星的色譜峰峰形更好。有機(jī)相為乙腈時(shí)，峰形更好、柱壓相對(duì)更低。綜合考慮選0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動(dòng)相，在此條件下，14種目標(biāo)化合物能有效分離。

2.5 提取條件的優(yōu)化

參考化妝品樣品的常規(guī)處理方法[9]，比較下列兩種處理方式：① 50%乙腈溶液直接超聲提取；② 飽和氯化鈉溶液處理后用乙腈提取。試驗(yàn)結(jié)果表明，加入飽和氯化鈉溶液處理后樣品溶液雜峰明顯減少。最終確定樣品前處理方式：準(zhǔn)確稱取化妝品樣品0.2 g（精確到0.0001 g），置于10 mL離心管中，準(zhǔn)確加入3 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋30 s，再準(zhǔn)確加入5 mL乙腈，超聲提取30 min，放至室溫后，加水定容至刻度，混勻，過濾后作為供試品溶液備用。

2.6 方法性能評(píng)估

2.6.1 線性關(guān)系與檢測(cè)限 在確定的最優(yōu)色譜和質(zhì)譜條件下，配制一系列不同濃度（6.22～256.80 ng·mL-1）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以各成分的定量離子對(duì)峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

2.6.2 基質(zhì)效應(yīng) 向水狀及粉狀陰性基質(zhì)中分別加入不同體積“2.2.1”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，配制成10、25、50、75、100、150 ng·mL-1的系列基質(zhì)對(duì)照品工作液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果司帕沙星為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，其余13種目標(biāo)組分均為強(qiáng)抑制效應(yīng)[14]。化妝品的水狀和粉狀基質(zhì)的存在影響了色譜系統(tǒng)活性位點(diǎn)與待測(cè)物分子的作用，使得14種待測(cè)成分檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)或減弱，在實(shí)際的樣品含量測(cè)定中，為減輕基質(zhì)效應(yīng)的影響，均以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算實(shí)際含量。

2.6.3 加標(biāo)回收率與重復(fù)性 取陰性的水狀樣品作為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定，精密稱取12份于10 mL比色管中（0.2 g/份），分別加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，使其達(dá)到10 ng·mL-1（低濃度，3份）、30 ng·mL-1（中濃度，6份）和50 ng·mL-1（高濃度，3份），準(zhǔn)確加入3 mL飽和氯化鈉溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算方法回收率和RSD，結(jié)果見表4，空白基質(zhì)在低、中、高濃度的提取回收率在83.7%～115.7%，RSD均小于5.0%。

以陰性水狀基質(zhì)加標(biāo)至中濃度（30 ng·mL-1）的6份樣品回收率結(jié)果計(jì)算重復(fù)性（見表4），14種目標(biāo)化合物的回收率在83.7%～108.7%，RSD均低于4.5%。

2.6.4 準(zhǔn)確度 為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，精密稱取水狀基質(zhì)和粉狀基質(zhì)陰性樣品各3份于10 mL比色管中（0.2 g/份），分別加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，使其達(dá)到30 ng·mL-1，準(zhǔn)確加入3 mL飽和氯化鈉溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理，結(jié)果見表5，不同基質(zhì)提取回收率均在83.0%～115.3%，RSD均小于5.0%。

表5 14種目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確度結(jié)果Tab 5 Method accuracy of 14 target compounds

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

共采集除臭化妝品126批，包含水狀和粉狀樣品，由于基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果影響較大，實(shí)際樣品含量測(cè)定中，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。經(jīng)檢測(cè)，1批樣品檢出烏洛托品1.7 mg·g-1，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）[9]將烏洛托品從準(zhǔn)用防腐劑目錄中刪除，但并未列入《已使用化妝品原料目錄》（2021年版），其安全性有待商榷；喹諾酮類物質(zhì)為禁用組分，經(jīng)檢測(cè)，大部分喹諾酮類物質(zhì)未檢出，極少樣品檢出目標(biāo)組分培氟沙星、恩諾沙星，但檢出量均低于方法檢測(cè)限（培氟沙星0.0057 μg·kg-1，恩諾沙星0.0050 μg·kg-1），無法準(zhǔn)確定量，且由于檢出峰較小，離子豐度比匹配不上，需進(jìn)一步確證。《化妝品監(jiān)督管理?xiàng)l例》[10]規(guī)定除臭化妝品監(jiān)管由注冊(cè)轉(zhuǎn)向備案，本次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該類化妝品仍存在風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)，建議化妝品監(jiān)管部門適當(dāng)增加該類化妝品的監(jiān)督抽檢，保障大眾用妝安全。

3 討論

3.1 分析方法優(yōu)化

烏洛托品及喹諾酮類物質(zhì)在除臭類化妝品中檢出量較低，對(duì)分析方法的靈敏度要求較高。文獻(xiàn)報(bào)道喹諾酮類物質(zhì)多采用高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)[15-16]；烏洛托品可采用氣相色譜法、液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[17]，都為單組分測(cè)定。本試驗(yàn)需要同時(shí)檢測(cè)烏洛托品和喹諾酮類物質(zhì)，綜合考慮采用UPLC-MS/MS法。化妝品成分復(fù)雜，對(duì)目標(biāo)組分易產(chǎn)生干擾，本試驗(yàn)樣品處理過程中，加飽和氯化鈉溶液破除基質(zhì)乳化效應(yīng)，沉淀部分雜質(zhì)后，再以提取溶劑提取目標(biāo)組分，能有效降低干擾，增強(qiáng)目標(biāo)成分的響應(yīng)值。在選擇流動(dòng)相時(shí)，充分考慮目標(biāo)組分的理化性質(zhì)，喹諾酮類物質(zhì)酸度系數(shù)（pKa）在5.5～6.9，在酸性介質(zhì)中更易電離[18]；烏洛托品作為甲醛緩釋劑，酸性條件下易電離[19]，選堿性甲酸銨緩沖鹽溶液能有效避免其分解。有機(jī)相選擇甲醇和乙腈時(shí)，目標(biāo)化合物色譜峰響應(yīng)值相當(dāng)，但乙腈為流動(dòng)相時(shí)，柱壓相對(duì)更低，目標(biāo)組分的峰形也更好。

3.2 研究結(jié)果分析

本研究發(fā)現(xiàn)，除臭化妝品中仍存在烏洛托品及個(gè)別抗菌成分檢出的情況，化妝品安全風(fēng)險(xiǎn)依然存在，UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定烏洛托品及13種喹諾酮類抗菌檢測(cè)方法可提高化妝品檢測(cè)的工作效率，利于監(jiān)測(cè)化妝品中抗菌物質(zhì)的含量，對(duì)化妝品中抗菌藥物的監(jiān)管和監(jiān)督具有重要意義。隨著社會(huì)的發(fā)展和科技進(jìn)步，化妝品中非法添加風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)種類不斷增加，多為目前標(biāo)準(zhǔn)體系外的組分，建議擴(kuò)展化妝品非法添加物質(zhì)庫，建立統(tǒng)一的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，降低化妝品中的高風(fēng)險(xiǎn)藥物成分引發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)；加強(qiáng)技術(shù)能力建設(shè)，開發(fā)高通量篩查系統(tǒng)，開展非法添加趨勢(shì)分析等，提高監(jiān)管系統(tǒng)打擊非法添加的能力。