ALK5小分子抑制劑生物活性研究進展

李倩倩，薛曉文，2*（.中國藥科大學藥學院，南京 200；2.中國藥科大學藥物化學教研室，南京 200）

轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一種多功能細胞因子，廣泛存在于哺乳動物的組織細胞和轉化細胞中，自20世紀70年代末被發現以來，已在哺乳動物中發現了33個該家族成員配體，包括TGF-β、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、激活素、抗繆勒式管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）、生長分化因子（growth and differentiation factors，GDF）和結節素（nodal）等。這些配體具有相似的結構，并共享信號轉導的基本機制，在生物體生殖細胞、胚胎和各種組織或器官中廣泛表達，與細胞增殖、分化、轉分化、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）重塑、衰老和細胞凋亡等多種細胞行為密切相關[1]。TGF-β配體通過與細胞膜表面的特異性受體（即TGF-β受體）結合才能發揮生理效應。ALK5為TGF-βⅠ型受體中研究最為廣泛的一個亞型，抑制該亞型可以產生抗腫瘤等作用。本文在介紹TGF-β、相應受體及相關信號通路的基礎上，對近年來報道的ALK5抑制劑的各種生物活性進行梳理，希望為今后的ALK5抑制劑研究提供有益參考。

1 TGF-β、TGF-β受體及相關信號通路

TGF-β是一種由兩個含有112個氨基酸的單體通過二硫鍵連接的蛋白質，目前已發現6種亞型，其中TGF-β1（占90%以上，活性最強）、TGF-β2 和TGF-β3 3種亞型常見于哺乳動物體內，它們能夠通過與TGF-βⅠ型受體（TβRⅠ，也稱為作為激活素受體樣激酶，ALK）和Ⅱ型受體（TβRⅢ）這兩種類型的跨膜受體的結合來觸發細胞內信號[2-3]。目前，已經鑒定出7個TβRⅠ亞型（ALK1～ALK7）和5個TβRⅡ亞型，這兩種受體在所有細胞中均能表達，它們可以與相應的TGF-β超家族成員形成特定的異性復合物進行信號傳遞，從而發揮相應的細胞功能。初始合成的TGF-β是以非活性前體的形式存在（即潛伏期TGF-β），需要通過潛伏TGF-β結合蛋白（latent TGF-βbinding protein，LTBP）和潛伏期相關肽（latency-associated peptide，LAP）組成的復合物激活后才能發揮相應的生物效應[4]。激活后的TGF-β首先與TβR Ⅱ結合進行信號傳導，將ALK5募集到高度保守的富含Gly-Ser的近膜區域（GS區）使其發生構象調節并激活[5]。然后，被激活的ALK5將信號進一步傳遞給其下游底物SMAD蛋白——SMAD2和SMAD3，便完成了經典的SMAD信號通路傳導（見圖1）[6]。

圖1 TGF-β/Smad 信號通路Fig 1 TGF-β/Smad signaling pathway

除了經典的SMAD信號通路，TGF-β還可以通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、Rho-Rock等激活非SMAD途徑，從而影響TGF-β因子下游的一些關鍵細胞的生長發育過程[7]。由于ALK5在TGF-β信號通路中起著至關重要的作用，因此被視為治療多種癌癥、纖維化疾病的重要靶點。近年來，ALK5抑制劑在治療其他疾病如青光眼、血腦屏障損傷及腸道疾病等方面也取得了一定的進展[8]。

2 ALK5抑制劑的生物活性

2.1 抗腫瘤作用

TGF-β是一種眾所周知的腫瘤促進因子，如何通過抑制其活性而發揮抗腫瘤作用一直都是研究熱點。體外研究顯示，ALK5抑制劑能夠有效阻斷SMAD蛋白的磷酸化，從而減少腫瘤的轉移，抑制腫瘤細胞的增殖。此外，ALK5抑制劑還可以通過阻斷癌細胞的免疫逃逸來防止腫瘤侵襲[9]。到目前為止，進行臨床試驗的ALK5小分子抑制劑有化合物Vactosertib（EW-7197，1）、Galunisertib（LY-2157299，2）、LY-3200882（3）和PF-06952229（4）（見圖2），且臨床試驗均為實體瘤方向。其中，LY-3200882因公司戰略調整，于2019年停止產品開發（NCT04158700）。另一產品PF-06952229早先用于治療具有高TGF-β特征和上皮-間充質轉化（EMT）表達的晚期或轉移性癌癥患者（NCT03685591），作為單一療法并與其他治療藥物聯合使用，后也因公司的戰略調整，于2021年停止了該產品的開發。

圖2 ALK5小分子抑制劑Fig 2 ALK5 small molecule inhibitors

Vactosertib是一種口服的可逆性TGF-βⅠ型受體酪氨酸激酶抑制劑，IC50為13 nmol·L-1[10]，用于治療晚期/轉移性癌癥等。目前，針對晚期/轉移性非小細胞肺癌（NSCLC）、轉移性胰腺導管腺癌和骨髓增生異常綜合征等多種實體瘤的臨床試驗正在展開。2017年，該化合物在美國被授予孤兒藥稱號，用于治療肝細胞癌。2020年，Vactosertib/紫杉醇聯合用藥在美國獲得孤兒藥資質，用于治療轉移性胃腺癌。2021年，該產品被指定為孤兒藥，用于治療胰腺癌。最近，Park等[11]研究表明，口服Vactosertib可以通過抑制氧化應激、EMT、癌癥干細胞（CSC）和纖維化來克服放療在乳腺癌治療中的局限性，因此，Vactosertib聯合放療在臨床上可能更適用于乳腺癌患者。

目前禮來公司對于Galunisertib（IC50＝56 nmol·L-1）的研究正處于Ⅱ期臨床開發階段（NCT01246986），用于治療肝細胞癌、膠質瘤和多形性膠質母細胞瘤，而該藥物用于骨髓增生異常綜合征治療的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗已經完成[12]。用于治療轉移性胰腺癌、神經膠質瘤、結直腸癌、乳腺癌、轉移性去勢抵抗性前列腺癌和子宮或卵巢癌肉瘤等的早期臨床試驗也已經或正在進行中。2013年，作為歐盟指定孤兒藥，Galunisertib用于治療肝細胞癌和神經膠質瘤。

目前處于臨床前研究的ALK5抑制劑較多，其中有3個結構值得關注。Zhang等[13]利用基于分子對接的虛擬篩選對商業天然產物庫進行篩選，發現黃酮苷山柰酚3-O-龍膽雙糖苷（KPF 3-O-G，5）（見圖2，IC50＝2.589 mol·L-1）是一種有效的ALK5抑制劑，這是近年來發現的為數不多的天然產物類ALK5抑制劑。該化合物能夠通過直接與ALK5的ATP位點結合，抑制Smad2的磷酸化以及Smad4的表達，從而減少細胞增殖并抑制TGF-β誘導的細胞遷移和侵襲。體內研究表明，KPF 3-O-G給藥（40 mg·kg-1）能夠減少人卵巢癌異種移植小鼠模型中的腫瘤生長，且無明顯毒副作用，表明KPF3-O-G具有開發成為腫瘤治療藥物的潛力。Xu等[14]以LY-3200882為先導，通過對其進行藥效團分析和分子對接研究，對分子中的連接環進行替換，得到了一系列4-（吡啶-4-氧基）-3-（3，3-二氟環丁基）吡唑衍生物，其中活性最好的化合物6（見圖2）（IC50＝30 nmol·L-1）的體外、體內活性及藥代動力學特征均優于LY-3200882，表現出良好的抗腫瘤療效。此外，由于p38α絲裂原活化蛋白激酶（p38αMAPK）對腫瘤壞死因子-α具有重要調控作用，因此，抑制p38αMAPK被視為治療腫瘤的一種有效手段[15-16]。近年來，對于ALK5及p38αMAPK雙靶點抑制劑的研究，也取得了較好的結果。Liu等[17]在前人研究的基礎上，設計合成了4-（1H-吲唑-5-基）-5-（6-甲基吡啶-2-基）-1H-咪唑和4-（1-甲基-1H-吲唑-5-基）-5-（6-甲基吡啶-2-基）-1H-咪唑兩個系列的化合物，并評估了它們對ALK5和p38αMAPK的抑制作用，結果顯示，化合物J-1090（7，見圖2）對兩者均表現出了強大的抑制作用，IC50值均為4 nmol·L-1。進一步的體外研究表明，該化合物能夠通過抑制TGF-β誘導的EMT來抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。

2.2 抗纖維化作用

TGF-β1最初被發現時，便因其能夠刺激軟瓊脂中培養的大鼠成纖維細胞的生長，而被認為是纖維化的主要細胞因子[18]。研究表明，在多種ECM積累引起纖維化的器官中都能夠觀察到TGF-β的過表達[19-20]。因此，抑制ALK5不失為對抗各種器官纖維化的有效策略。目前，抗纖維化作用的ALK5小分子抑制劑均處于臨床前研究階段，尚未有藥物進入臨床研究階段。

Yue等[21]在MPLW515L和JAK2V617F小鼠模型中，發現Galunisertib無論在體內還是體外，均能夠消除由于骨髓纖維化引起的膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的持續過量產生，明顯改善了小鼠的骨髓纖維化程度，為阻斷ALK5作為骨髓纖維化治療策略提供了臨床前依據。Ferreira等[22]使用GW-788388（8，見圖2）對克氏錐蟲（來自哥倫比亞毒株的102種寄生蟲）感染后的小鼠進行口服治療（3 mg·kg-1），發現GW-788388 有效逆轉了富含連接蛋白-43的細胞間斑塊的損傷，并減少了心臟組織的纖維化，因此，抑制TGF-β通路可能是美洲錐蟲病心臟病慢性期心臟纖維化治療的重要且可靠的策略。

Rezníckova等[23]設計并合成了一系列以2，3，4-取代的5，5-二甲基-5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑結構為核心的衍生物，其中化合物9（見圖2）活性最好，對ALK5的IC50值為80 nmol·L-1。細胞研究表明，這些化合物能夠通過引起Smad2/3的劑量依賴性去磷酸化，阻斷Smad2/3向TGF-β刺激的細胞核的轉位，呈現出抗纖維化作用。Zhu等[24]報道了一系列含有[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-6-基部分的化合物，并評估了這些化合物對ALK5和p38α激酶的抑制活性，發現在吡唑環的4-位插入苯并[c][1，2，5]噻二唑-5-基部分可顯著提高ALK5激酶的活性。其中最有效的化合物10（見圖2）的IC50值為30 nmol·L-1，對p38α激酶的選擇性指數為235，是LY-2157299的59倍，與EW-7197相當。免疫細胞化學染色、蛋白質印跡和RT-PCR測定結果均顯示化合物10有效抑制了TGF-β誘導的肝星狀細胞（HSC）活化，對肝纖維化治療表現出極高的治療潛力，有望成為治療肝纖維化的臨床前候選藥物。Zheng等[25]設計合成了多種噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基吡唑衍生物，并評價了它們對ALK5的抑制活性，發現化合物 J-1063（11，見圖2）（IC50＝30 nmol·L-1）能夠有效抑制TGF-β誘導的活化HSC的纖維化和炎癥，減少硫代乙酰胺誘導的小鼠肝纖維化中巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤，其延緩肝纖維化的進展及抑制伴隨的炎癥的能力明顯優于Galunisertib。該化合物不僅具有優越的藥理作用，而且合成相對簡單，是治療和預防肝纖維化的有希望的候選藥物。

Xie等[26]通過虛擬篩選和藥效團構建設計并合成了一種新型ALK5小分子抑制劑Cpd-0225（12，見圖2），生物活性研究表明該化合物能夠通過阻斷Smad依賴性和非Smad依賴性信號通路，發揮腎保護作用，在體外或體內均能發揮作用，且在相同劑量下，比SB-431542（13，見圖2）具有更好的抗纖維化作用，有望成為治療慢性腎病的有效臨床候選藥物。此外，由于對成纖維細胞具有較好的抑制作用，SB-431542最新用于青光眼小梁切除術后濾過泡瘢痕化的防治，且有望替代早先使用的絲裂霉素C等細胞毒類藥物，因為ALK5抑制劑具有更低的細胞毒性[27]。

2.3 促進腸神經膠質細胞轉化為神經元

腸神經系統（enteric nervous system，ENS）由腸壁中的肌間神經叢和黏膜下神經叢組成，該系統主要包含腸膠質細胞和腸神經元。多種不良因素，如炎癥、衰老、飲食改變、代謝紊亂等，都可能導致腸神經元損傷或ENS功能失調，從而引起胃腸動力和感覺功能障礙，如胃輕癱、腸易激綜合征和先天性巨結腸等[28-30]。對于患有先天性巨結腸的兒童，手術切除整個腸道結腸或部分結腸仍然是治療的主要選擇，但這種治療不能預防生命后期發生的小腸結腸炎、便秘或失禁等終生并發癥。盡管在成人腸道中產生新神經元的手段相對有限，但添加新的腸神經元來替代受損的神經元將仍是修復ENS功能障礙的解決方案。

Medina等[31]研究發現，SD-208（14，見圖2）能夠通過TGF-β/ALK5/SMAD通路參與實驗性腸纖維化的發病機制，在厭氧菌和三硝基苯磺酸誘導的結腸炎的動物模型中，有效抑制由于Smad2和Smad3的磷酸化以及ALK5蛋白、組織金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMP）和Ⅰ型膠原α2（α2 type 1 collagen,COL1α2）重組蛋白表達上調產生的纖維化。Shi等[32]發現在正常成年小鼠模型中，用RepSox（15，見圖2）3及10 mg/（kg·d）灌胃，持續給藥2周，結果顯著促進了ENS中腸神經膠質細胞向神經元的轉化，并對小鼠的胃腸道運動產生了一定的影響。EW-7197和LY-257299也能產生與SD-208相似的效果，并且利用shRNA下調腸神經膠質細胞中ALK5的表達也會產生類似效果，進一步證實了ALK5信號通路在腸神經膠質細胞向神經元的轉變中發揮了重要作用。這些結果表明，抑制ALK5可能是一種有前途的治療腸道疾病的有效策略。

2.4 血腦屏障保護作用

研究表明，星形膠質細胞中TGF-β受體的條件性基因敲除或TGF-β信號傳導的藥理學抑制均能夠逆轉老年小鼠的血腦屏障受損（blood brain barrier disruption，BBBD）。同時，在接受TGF-β抑制治療的患有血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的老年人群受試者中，發現同樣的信號通路被激活[33]。

Atis等[34]通過使用SB-431542對血管緊張素（angiotensin，ANG）Ⅱ誘導的高血壓小鼠進行治療，發現SB-431542能夠降低由于ANGⅡ輸注引起的BBB對白蛋白Alexa fluor 594的滲透性的增加，因此抑制TβRⅠ可以防止高張力條件下BBBD，可作為一種新的治療方式來保護高血壓患者的大腦。Preininger等[35]使大鼠海馬體長期暴露于血清白蛋白，通過TGF-β信號傳導誘導星形膠質細胞應激誘導的早衰，發現在對BBBD大鼠模型每日使用ALK5抑制劑IPW-53715（結構未見公布）進行給藥后，海馬組織中衰老星形膠質細胞的負擔顯著減輕，這也進一步驗證了ALK5抑制劑IPW-5371能夠有效預防BBBD。

2.5 降低眼壓作用

青光眼是一種進行性眼部疾病，可導致不可逆的視網膜神經節細胞死亡，是全球視力喪失的主要原因。由于現有藥物或治療方法均會產生耐藥性或者不同程度的不良反應如心律失常和支氣管收縮等，因此亟需開發治療青光眼的新療法[36-37]。

眼內壓（intra-ocular pressure，IOP）升高是青光眼發生和發展最重要的危險因素，降低IOP已被證明可有效治療青光眼。IOP由房水的產生和流出控制，小梁網是房水從眼睛排出的主要途徑。Aoshima等[38]研究表明，ALK5抑制劑SB-431542能夠通過抑制小梁網中ECM的產生達到降低IOP的目的，并且其作用優于Rho相關的卷曲蛋白激酶抑制劑Y-27632，每日一次重復使用可增強小鼠的IOP降低效果。因此，ALK5抑制劑或許可以作為治療青光眼的新療法進行開發。

3 小結與展望

TGF-β幾乎滲透到人體內各生物學過程中的方方面面，形成了一個巨大的信號網絡，其生物活性的研究一直都在進行中。ALK5作為TGF-β/Smad信號通路中不可或缺的一環，其抑制劑在TGF-β抑制劑中占據著舉足輕重的地位。雖然至今尚未有ALK5小分子抑制劑被批準上市，但目前在研藥物中，EW-7197和LY-2157299在臨床試驗中均有良好的表現，并且不少活性好的新型小分子抑制劑也不斷被發現。尤其是具有ALK5抑制活性的天然產物也逐漸被發現，對其進行結構改造也呈現出廣闊的前景。在生物活性方面，ALK5小分子抑制劑除了具有抗腫瘤和纖維化作用以外，在腸道疾病、BBBD和青光眼治療等方面也有一定的價值。總之，隨著對ALK5小分子抑制劑的研究深入，更多安全有效的ALK5小分子抑制劑將進入臨床發揮治療作用。