金屬藥物在腫瘤免疫原性細胞死亡中的研究進展

王欣如，郝炳榮，孫麗新，李欣（中國藥科大學江蘇省藥效研究與評價服務中心，南京 210009）

惡性腫瘤已成為全球主要的致死性疾病之一，對人類的生命健康構成了嚴重的威脅，為全球經濟帶來了沉重的負擔[1-2]。目前，惡性腫瘤的治療手段以手術切除、化學療法、放射療法等常規方法為主，而這些方法具有副作用大、療效差、易轉移和復發率高等缺點，容易導致患者預后不良甚至死亡[3]。免疫療法是一種新興的治療手段，彌補了傳統治療方法的不足[4]。其中，誘導腫瘤細胞發生免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death，ICD）是免疫療法的一種類型。該療法表現為化療在非特異性殺傷腫瘤細胞時可以通過多種機制增強腫瘤細胞的免疫原性，腫瘤細胞在發生死亡的同時，由非免疫原性轉化為免疫原性而介導抗腫瘤免疫應答，激活免疫系統攻擊腫瘤細胞，從而抑制腫瘤生長甚至根除腫瘤。

以往的觀點認為金屬藥物主要通過非特異性細胞毒性作用殺死腫瘤細胞。然而，越來越多的證據表明，順鉑、奧沙利鉑、三氧化二砷等經典金屬化療藥物和新型金屬配合物在發揮細胞毒性的同時，還可以誘導機體產生抗腫瘤免疫反應[5-6]。金屬藥物誘導抗腫瘤免疫反應的作用涉及免疫效應器的直接激活或失活、腫瘤細胞的免疫識別以及誘導ICD等多個方面[7]。

本文就ICD的作用機制、分子標記及ICD誘導劑的研究現狀進行綜述，并在此基礎上總結可誘導ICD的金屬藥物的研究進展，以期為開發誘導ICD的金屬藥物提供參考。

1 誘導腫瘤細胞發生ICD的分子機制

ICD是一種調節性細胞死亡（regulated cell death，RCD），也是一種新型的腫瘤免疫治療方法[8]。在放療和部分類別化療藥物的作用下，垂死的腫瘤細胞可產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），產生的ROS通過激活特定的信號通路或直接作用于內質網，引發內質網應激。在內質網應激的驅動下，許多ICD相關的損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）[如鈣網蛋白（calreticulin，CRT）、高遷移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）等]被運輸或分泌到細胞外，這些DAMPs會促進樹突狀細胞（dentritic cell，DC）的成熟活化，成熟的樹突狀細胞通過活化γδT細胞使其產生白細胞介素-17（IL-17），增加細胞毒性T細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）對腫瘤組織的殺傷，或者直接將抗原呈遞給CTLs[9]，CTLs被招募到腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）后，在腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等各種促炎細胞因子的作用下殺傷殘留的腫瘤細胞[10]（見圖1）。

圖1 ICD死亡機制的示意圖Fig 1 Scheme of mechanism of ICD

當腫瘤細胞發生ICD時，釋放的DAMPs除了CRT、HMGB1和ATP之外，還包括熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）、Ⅰ型干擾素（type 1 IFN）和膜聯蛋白A1（annexin A1，ANXA1）等。下文將綜述這些與ICD相關的DAMPs激活免疫系統的作用機制。

1.1 CRT在ICD中的作用機制

CRT是一種46 kDa的Ca2+結合蛋白，是內質網腔中最豐富的蛋白質之一，具有分子伴侶活性和調節Ca2+穩態的功能[11]。在ICD發生早期，誘導劑激活蛋白激酶R樣內質網激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK），導致真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2 alpha，eIF2α）被磷酸化，進而募集轉錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4），最終使內質網發生應激反應[12]。在應激作用下，CRT通過胞吐的形式轉運到細胞膜外，內質網蛋白57（endoplasmic reticulum protein 57，ERp57）重新定位，一旦CRT與ERp57復合物暴露在細胞表面，就會發出“Eat me”信號，誘導腫瘤抗原呈遞并刺激機體發生特異性免疫反應，殺傷細胞[13]。

1.2 HMGB1在ICD中的作用機制

HMGB1是一種染色質結合蛋白。在ICD發生后期，由于細胞膜透化，HMGB1被釋放到細胞外，可與抗原呈遞細胞上的模式識別受體結合[14]。HMGB1與Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）結合后會活化髓樣分化因子（myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88），抑制吞噬體和溶酶體的融合，從而加速樹突狀細胞的成熟和對抗原成分的吞噬[15-16]。

1.3 ATP在ICD中的作用機制

ICD發生過程中分泌ATP需要自噬的調控，這意味著自噬缺陷的腫瘤細胞將無法引發相關的免疫反應[17]。ATP被分泌后，作為“Find me”信號與嘌呤受體P2Y2相互作用，將未成熟的樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞吸引到垂死腫瘤細胞部位[18]。此外，ATP還可介導核苷酸與嘌呤受體P2X7的相互作用，引起NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體的激活，從而使促炎細胞因子分泌增加[19]。

1.4 HSPs在ICD中的作用機制

HSP70和HSP90在垂死腫瘤細胞膜上的表達具有免疫刺激特性[20]。在發生ICD時，HSP70轉移到細胞膜上，與共刺激分子CD40相互作用從而促進包括CTLs在內的CD8+T細胞的活化[21]；HSP90與樹突狀細胞上的CD91相互作用從而促進腫瘤抗原向CTLs的交叉呈遞。這些過程促進了機體免疫系統的激活，對治愈腫瘤具有重要意義。

1.5 Type 1 IFN在ICD中的作用機制

Type 1 IFN是啟動免疫應答、激活效應T細胞和自然殺傷細胞的關鍵細胞因子，具有抗病毒和免疫調節作用[22-23]。當腫瘤細胞發生ICD時，胞質核酸分泌到胞外，內源性RNA激活Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）產生Type 1 IFN，導致CXC-趨化因子配體10（CXC chemokine ligand-10，CXCL10）釋放，從而發揮免疫刺激作用[24]。同時，胞質DNA的積累會通過激活cGASSTING通路誘導樹突狀細胞分泌Type 1 IFN，進而增強CD8+T細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的殺傷作用，并提高記憶T細胞的活力[25-26]。

1.6 ANXA1在ICD中的作用機制

ANXA1在中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞等多種細胞中存在[27]。ANXA1與磷脂結合并影響類花生酸的產生[28]，對炎癥的調節和消退具有重要作用。在ICD發生過程中，垂死腫瘤細胞釋放ANXA1，激活抗原呈遞細胞并促使其向腫瘤細胞遷移，促進免疫細胞對腫瘤細胞的吞噬[29]。

2 ICD誘導劑研究現狀

自首次發現阿霉素具有ICD誘導能力之后，多種臨床藥物也被發現可以誘導ICD，這些藥物被統稱為ICD誘導劑。在體外檢測腫瘤細胞經藥物處理后ICD相關DAMPs只能確定藥物是否具有誘導ICD的潛力，因此還需進行小鼠疫苗接種實驗來進一步評價其是否為ICD誘導劑。小鼠疫苗接種實驗模型（見圖2）于2005年由Casares等[30]首次提出，在體外用受試化合物誘導小鼠腫瘤細胞死亡，然后將處理過的垂死腫瘤細胞接種到具有免疫活性的同源小鼠的一側，一周后，將相同類型的未處理的腫瘤細胞接種到小鼠的另一側。接種后，監測無瘤小鼠的比例，能夠顯著減少腫瘤發生的化合物即可被認為是ICD誘導劑。這是由于被ICD誘導劑處理過的垂死腫瘤細胞可作為“無毒抗原”，注射時激活小鼠免疫系統，當表達相同抗原的腫瘤細胞再次被接種后，免疫系統原有的記憶再次激活，產生強烈的免疫應答來阻止腫瘤細胞的生長，發揮“腫瘤疫苗”的作用。因此，誘導腫瘤細胞發生ICD具有提高腫瘤治療效果和改善患者預后的潛力。

圖2 ICD的實驗性定義Fig 2 Experimental definition of ICD

除了小鼠疫苗接種實驗之外，涉及ICD發生過程的多種相關指標也用于ICD誘導劑的評估標準，包括各種DAMPs的水平、T細胞的數量、T細胞的免疫表型（如確定CTLs的表型）、相關細胞因子的水平（如IFN-γ、TNF-α），通過檢測這些指標可提示ICD誘導劑作用的可能位點[31]。

研究發現ICD誘導劑主要作用于各種細胞器，例如內質網、溶酶體、線粒體和細胞核[32]。內質網應激被認為是觸發ICD的關鍵事件。Vanmeerbeek等[33]發現大多數ICD誘導劑具有誘導內質網應激的能力。因此，根據ICD誘導劑誘發腫瘤細胞內質網應激機制的差異對其進行分類。ICD誘導劑被分為Ⅰ型、Ⅱ型兩種類型（見表1），其中Ⅰ型是ICD誘導劑的主要類型[34]。Ⅰ型誘導劑作用于腫瘤細胞后，通過靶向細胞溶質蛋白、影響DNA復制、干擾質膜和線粒體膜通道等間接介導內質網應激，導致細胞發生氧化應激從而誘導ICD[35]。Ⅱ型誘導劑與Ⅰ型的不同之處在于它直接選擇性地作用于內質網，改變其穩態使內質網應激從而誘導ICD。與Ⅰ型誘導劑相比，Ⅱ型誘導劑可增加DAMPs的分泌，具有更強的ICD誘導能力，在抗腫瘤免疫方面更有優勢[36]。

已知的臨床ICD藥物大都屬于Ⅰ型誘導劑，這些ICD誘導劑可能依賴于特定的腫瘤類型，即一種腫瘤的ICD誘導劑可能對另一種腫瘤無效，因此現有的藥物無法滿足臨床需求[37]。通過表型篩選，已經發現了一些具有ICD 誘導能力的天然產物，如辣椒素、紫草素、白藜蘆醇等[38]。

與此同時，除了奧沙利鉑，多種直接作用于內質網的金屬配合物也被發現可以誘導ICD，提示金屬配合物除了具有細胞毒性作用之外，還可以通過誘導ICD發揮抗腫瘤作用，這可以提升金屬配合物的臨床使用價值，也為ICD誘導劑的開發提供了一個豐富的資源庫。

3 金屬配合物在誘導ICD中的作用

與有機化合物相比，金屬配合物具有結構多樣性、配體交換、氧化還原特性和催化特性等性質[39]，因此能夠實現獨特的作用機制。越來越多的金屬配合物被證明具有誘導ICD的能力，下面將系統概述金屬配合物作為ICD誘導劑的研究進展。

3.1 鉑類藥物在誘導ICD中的作用

順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等鉑類配合物用于全世界超過50%癌癥患者的治療[40]，是應用最廣泛的抗腫瘤藥物之一，對多種癌癥具有公認的療效。長期以來，人們普遍認為鉑類藥物的抗腫瘤機制是通過損傷DNA從而引起腫瘤細胞死亡[41]。然而，最近發現此類藥物還可以通過誘導腫瘤細胞發生ICD，進而增強免疫系統對腫瘤細胞的殺傷作用，實現更優的抗腫瘤效果。

3.1.1 經典鉑類藥物 在誘導ICD方面，不同的鉑類藥物之間表現出很大差異。Tesniere等[42]發現奧沙利鉑可以在結腸癌細胞中引發ICD介導免疫反應，順鉑則不能，其原因可能是奧沙利鉑會引起結腸癌細胞強烈的內質網應激反應。另一項研究評估了一線抗腫瘤藥物卡鉑的免疫原性作用，結果顯示，與奧沙利鉑、順鉑不同，卡鉑在多種非小細胞肺癌細胞系中可以引發CRT易位，但在非小細胞肺癌細胞系A549中卻不能引發CRT易位，且不能促使ATP和HMGB1釋放[43]。這提示了經典鉑類藥物的ICD誘導能力可能具有一定的腫瘤細胞選擇性，但目前的研究仍較少。

3.1.2 新型Pt（Ⅱ）配合物 除了經典的鉑類藥物，一些通過結構修飾開發出的Pt（Ⅱ）配合物，也表現出了很強的ICD誘導效應。Wong等[44]報道了除FDA批準的鉑類藥物外第一個可引起ICD的金屬配合物Pt-NHC。后續研究發現，Pt-NHC誘導ICD是通過直接觸發內質網應激產生ROS介導的，屬于Ⅱ型ICD誘導劑[45]。對Pt-NHC結構進行修飾得到Platin-ER[46]，發現其是通過促進小鼠結腸癌細胞CT26中HSP90的釋放從而誘導腫瘤細胞發生ICD。Huang等[47]報道了一種含有氨基磷酸鹽配體的新型鉑（Ⅱ）配合物Pt-1，Pt-1可以誘導人膀胱癌細胞發生ICD，同時還可促進樹突狀細胞成熟以及IFN-γ、TNF-α分泌增加。Yamazaki等[48]報道了一種含焦磷酸鹽配體的鉑（Ⅱ）配合物PT-112，它可與免疫檢查點阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）療法協同作用誘導更強的免疫反應。PT-112與PD-L1阻斷劑聯用還可促進CTLs浸潤，這種ICD和ICB協同作用的新方法，有望在結直腸癌的治療中產生更好的療效。這些新型的Pt（Ⅱ）藥物，都是在發揮原有的化療作用的同時，引發了ICD反應，提示其具有化療與免疫治療相結合的能力，該類藥物具有良好的開發前景。

3.1.3 新型Pt（Ⅳ）藥物 相較于Pt（Ⅱ）配合物，新型Pt（Ⅳ）藥物具有配體交換惰性的特點，且易進行功能化修飾，同時新穎的結構和多樣化的活性機制使其擁有了更多優異的性質。Sabbatini等[49]報道了一種以組蛋白脫乙酰酶抑制劑為配體的Pt（Ⅳ）配合物，可促進結腸癌細胞的免疫調節作用，誘導強大的ICD反應。Groer等[50]將Pt（Ⅳ）-生育酚與透明質酸納米載體絡合，開發了一種ICD誘導劑HA-Pt（Ⅳ），在口腔鱗狀細胞癌細胞中可促進CRT外翻，在小鼠疫苗接種實驗的免疫健全小鼠中觀察到良好的腫瘤抑制效果。Sun等[51]設計合成了辣椒素衍生物修飾的鉑（Ⅳ）化合物，該化合物不僅會導致DNA損傷，還可引發人胰腺癌細胞PANC-1細胞CRT的易位，并伴隨ATP和HMGB1的釋放，對人胰腺癌細胞表現出有效的ICD誘導作用。目前Pt（Ⅳ）配合物誘導ICD的構效關系尚未明確，推測軸向上接入的配體的化學結構和生理功能可能是Pt（Ⅳ）配合物誘導ICD的關鍵因素。因此，進一步探尋其構效關系將有助于新型可誘發ICD的Pt（Ⅳ）配合物的設計開發。

合理設計的光籠鉑配合物，可以用光實時控制并激活，有助于避免“脫靶”效應并可以引發ICD介導的抗腫瘤反應。基于這些潛在的益處，Deng等[52]報道了一種基于奧沙利鉑的光籠Pt（Ⅳ）前藥，它可實現有效地核仁積累以及“按需”激活。在光激活后，可誘導順鉑耐藥肺癌細胞發生ICD，以獨特的作用方式逆轉耐藥，這為設計可控激活和靶向核仁的Pt（Ⅳ）前藥提供了一種新方向。Novohradsky等[53]報道了一種可被光活化的Pt（Ⅳ）配合物，在被可見光激活后具有強細胞毒性，能產生Pt（Ⅱ）并釋放疊氮基和羥基自由基，同時通過引發自噬促進釋放DAMPs從而誘導ICD。這種獨特的免疫調節特性使光籠鉑配合物有別于其他鉑類藥物，可能會顯著增強抗腫瘤功效，同時也證實自噬在促進垂死細胞釋放ATP，增加免疫原性方面發揮重要作用。

3.2 銥配合物在誘導ICD中的作用

銥（Ⅲ）配合物由于具有強大的抗腫瘤活性而被關注并進行研究。近年來，有文獻報道銥（Ⅲ）配合物具有誘導ICD的作用。

Wang等[54]研究設計了一個含有環磷酰胺類似物的Ir（Ⅲ）配合物，其在A549細胞中選擇性定位于內質網并引起CRT外翻、促進HMGB1和ATP釋放。但在人乳腺癌細胞（MDA-MB-231）中ICD誘導效率低下，說明該銥配合物誘導ICD依賴于特定的腫瘤類型，但具體機制尚不清楚。Vigueras等[55]報道了一種光活化的Ir（Ⅲ）配合物，其作用于人黑色素瘤細胞A375后選擇性定位于線粒體和內質網并引發ICD，提示該Ir（Ⅲ）光敏劑作為ICD誘導劑開發具有良好的前景。Wang等[56]最新報道了一種可高效誘導ICD的光敏劑Ir（Ⅲ）復合物Ir-pbt-Bpa，在光照射下產生單線態氧和超氧陰離子自由基，通過同時誘導鐵死亡和ICD的方式殺傷黑色素瘤細胞，從而實現長期的抗腫瘤作用。綜上，這些Ir（Ⅲ）配合物具有復合功能，在直接作用于腫瘤細胞時，還可通過ICD抑制腫瘤，綜合發揮藥效，為后續銥配合物的開發提供了參考。

3.3 釕配合物在誘導ICD中的作用

由于釕（Ru）配合物不僅可以與DNA結合，還具有較強的蛋白結合能力，因此基于釕的金屬配合物很早就開展了抗腫瘤活性研究。目前，已有四種釕基配合物作為抗腫瘤藥物進入臨床研究[57]。然而，直到近些年，釕配合物作為ICD誘導劑的潛力才開始得到關注。

Wernitznig等[58]對一種已進入臨床研究的釕基藥物KP1339進行了ICD誘導能力研究。通過人結腸癌細胞HCT116細胞球體模型研究發現，KP1339可以介導結腸癌細胞產生CRT易位以及其他ICD相關的標志物。他們還設計了一種Ru（Ⅱ）芳烴配合物plecstatin-1[59]，在人結腸癌細胞中可以使ROS增加，刺激CRT暴露，介導伴侶蛋白HSP70和HSP90的表達增加，從而誘導ICD。許多基于釕的金屬配合物是高效的光敏劑，Konda等[60]設計了兩種具有雙重抑制模式的Ru-PDT復合物ML19B01和ML19B02可以在黑色素瘤細胞中通過光動力療法（photodynamic therapy，PDT）誘導ICD，并激活炎癥通路，使腫瘤生長延遲、腫瘤負荷減少，提示了釕類藥物有望通過聯合PDT提高抗腫瘤效果，甚至防止腫瘤復發。

3.4 金配合物在誘導ICD中的作用

金配合物作為潛在的抗腫瘤劑越來越受到關注。金配合物主要是通過抑制硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）活性發揮細胞毒性作用。直到最近，有研究發現金配合物可刺激免疫系統發生免疫反應，誘導腫瘤細胞發生ICD[61]。

Sen等[62]報道了一種含萘醌結構的化合物Au（Ⅰ）-NHC，它可通過升高ROS的水平和減少ROS的失活來誘導腫瘤細胞死亡，其中大多是通過誘導ICD導致的腫瘤細胞死亡。Mule等[63]研究了一種具有強效抗腫瘤效果的新型Au（Ⅰ）配合物BQ-AurIPr，能夠有效促進DAMPs的產生，顯著增加腫瘤細胞的免疫原性，與FDA批準的誘導ICD的藥物阿霉素和奧沙利鉑相比，具有更高的ICD誘導效率。金諾芬（auranofin，AF）是一種金配合物，1985年被批準用于風濕性關節炎的治療。AF是一種TrxR抑制劑，Van等[64]報道了一種將AF和低溫常壓等離子體聯合處理的策略，聯合治療后發現，膠質母細胞瘤細胞中TrxR活性降低、ROS水平升高，ICD相關的DAMPs分泌顯著增加，提示AF具備ICD誘導能力。綜上，這些金配合物都表現出了強大的ICD誘導能力，大多通過升高細胞內ROS的水平介導內質網應激來觸發ICD。

3.5 銅配合物在誘導ICD中的作用

銅（Cu）是一種內源性金屬，當其與適當的配體形成銅配合物時，可用于提高細胞內的ROS水平。這為設計銅配合物的ICD誘導劑提供了思路。Kaur等[65]研究了一種靶向內質網并產生ROS的銅配合物，該配合物在乳腺癌干細胞中可以誘導ICD，從而有效抑制乳腺癌干細胞的增殖。Wang等[66]報道了一種可有效誘導ICD的銅基納米級配合物Cu-NCPs，其在與放射治療聯用時顯示出協同作用，結合PD-L1阻斷療法可增強免疫反應，提示Cu-NCPs作為ICD誘導劑在腫瘤治療中具有應用前景。

除了以上幾類常見的具有抗腫瘤活性的金屬配合物可誘導ICD外，最近一些含其他金屬（如砷[67]、鐵[68]、鋨[69]等）的配合物也被證實具有誘導ICD的能力，其誘導機制包括介導ROS產生、內質網應激等，說明金屬藥物誘導腫瘤細胞發生ICD的研究受到了更多的關注，這有助于提高金屬藥物ICD誘導劑的研究水平和后續的開發研究。

4 總結與展望

現有的研究表明從垂死腫瘤細胞中釋放的DAMPs可以激活特定抗腫瘤免疫反應的能力，誘導ICD從而發揮抗腫瘤作用。誘導ICD是一種新型腫瘤免疫療法，具有良好的臨床應用前景。

在確認ICD的研究中，還有很多需要繼續解決的問題，如導致某種細胞死亡方式具有免疫原性的因素尚不清楚，對影響垂死腫瘤細胞免疫原性的因素也了解不多。目前的ICD 研究主要是在腫瘤細胞和腫瘤疫苗接種模型（小鼠疫苗接種實驗）中進行的，但小鼠疫苗接種實驗具有明顯的限制性且只有少量同基因腫瘤模型；更重要的是，由于不同物種間的不相容性，也無法評估人類腫瘤細胞在小鼠體內的免疫作用，因此構建合適的體內篩選與驗證模型變得尤為重要，如開發原位和基因工程小鼠模型以測試ICD。

了解腫瘤治療藥物誘導釋放DAMPs和激活機體免疫系統的分子途徑和分子機制可評估其將細胞死亡的非免疫原性誘導劑轉化為ICD誘導劑的潛力，也可為改進腫瘤疫苗接種策略提供理論參考。相比于其他類型的ICD誘導劑，金屬ICD誘導劑的開發具有作用強的特點，但仍然存在一些亟待解決的問題。金屬藥物誘導ICD的能力目前還不能根據其化學結構或性質來預測，因此確定金屬藥物與誘導ICD之間的構效關系是目前亟待解決的問題。確定合適的劑量和給藥時間以實現最優的免疫治療效果是金屬ICD誘導劑臨床研究的重要挑戰。

總之，誘導ICD的金屬藥物是抗腫瘤藥物研究的一個快速發展的領域，已經顯示出良好的應用前景。隨著研究的深入和研究水平的提高，具有ICD作用的金屬藥物將獲得更多的關注和研究，并為臨床腫瘤的免疫治療提供新的治療藥物。