基于Zeta電位表征血小板因子4/依諾肝素鈉復合物的方法學研究

趙婧雯，歐陽藝蘭，錢玉蘭，劉志，易琳*，張真慶*（.蘇州大學藥學院，江蘇 蘇州 5006；.蘇州大學附屬第一醫院，江蘇 蘇州 59；.蘇州二葉制藥有限公司，江蘇 蘇州 500）

肝素治療中常伴有血小板減少癥（heparin induced thrombocytopenia，HIT），HIT分為兩種：一種是無免疫機制參與的HIT-Ⅰ型，癥狀輕微，病程呈自限性[1]；另一種是HIT-Ⅱ型，是一種免疫反應，常伴有血栓發生[2]。臨床上，HIT通常是指HIT-Ⅱ型。HIT是肝素治療過程中的嚴重并發癥，據臨床統計，肝素引發HIT的發生率約為3%[3-5]，低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWHs）引發HIT的發生率約為0.2%。雖然肝素類藥物引起的HIT發生率并不高，但由HIT引發的血栓概率卻達30%～70%，HIT導致的截肢和死亡概率更是分別達10%和20%～30%[6-8]，這些嚴重威脅患者的健康與生存。

大量研究表明由肝素（heparin，Hp）、血小板因子4（PF4）、它們的復合物（PF4/Hp）以及復合物的反應性抗體組成的超大復合物（ultra large complex，ULC）是誘發HIT的關鍵[9-12]。血小板α顆粒釋放的PF4與Hp有較強的結合能力，它們的復合物能夠刺激免疫細胞釋放IgG抗體，IgG通過Fab片段與PF4/Hp復合物特異性結合，形成PF4/Hp/IgG三元復合物，即HIT抗體。HIT抗體通過IgG上的Fc片段，與血小板上的FcγRIIa受體結合，進一步激發機體的免疫反應：一方面，激活的Fc片段介導巨噬細胞的吞噬作用，使HIT抗體連同血小板被巨噬細胞清除，引起血液中血小板減少；另一方面，激活血小板，使活化的血小板釋放更多的凝血因子，并促使血小板聚集而形成動靜脈血栓，這種伴有凝血級聯反應的免疫原性反應，稱為肝素引起的血小板因子減少綜合征，即HIT綜合征[13-18]。

LMWHs是由未分級肝素經酶解、化學降解等方式制備的產品，不同的生產工藝產生不同種類的LMWHs，如目前臨床應用最廣泛的依諾肝素鈉（enoxaparin sodium，Eno）是肝素芐酯化后再堿解制備而來[19]。與Hp相比，LMWHs具有出血不良反應小、生物利用度高、半衰期長、患者依從性好等優點[8，20-21]，在臨床上LMWHs正在逐漸替代Hp，成為治療深度血栓等疾病的主要產品。LMWHs具有更低的分子量，其引起的HIT綜合征發生率明顯低于肝素，但鑒于HIT引發血栓、壞死等嚴重不良反應的風險，LMWHs的免疫原性評估依然是業界關注的重點[22]。

2016年，美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）將LMWHs免疫原性研究列入仿制藥生產指導原則，即ImmunogenicityRelatedConsiderationsforLowMolecularWeightHeparin[23]；同年歐洲醫藥管理局（European Medicines Agency，EMC）同樣強調了LMWHs類免疫原性評估的必要性，并發表了相應的指導原則，即Guidelineonnon-clinicaland clinicaldevelopmentofsimilarbiologicalmedicinal productscontaininglowmolecular-weight-heparins[24]；2020年國家藥監局藥品審評中心進一步規范了國內LMWHs類仿制藥一致性評價過程中的免疫原性評估要求[25]。以上指導原則均將評估PF4-LMWHs復合物的表面電荷作為重要工作內容之一。帶有強正電荷的蛋白PF4與帶有強負電荷的LMWHs通過靜電相互作用形成PF4-LMWHs復合物，復合物表面強正電荷或強負電荷使復合物在溶液中穩定分散，而當復合物表面電荷表現出減少或是呈中性狀態時，復合物傾向于聚集[26]，因此評估LMWHs對PF4的電中和能力，即不同摩爾比下PF4與LMWHs形成復合物的表面電荷高低，對反映LMWHs潛在的免疫原性至關重要。溶液中顆粒表面的電荷會引起附近粒子不同程度的聚集，這種聚集會在粒子表面產生一定的電勢，該電勢可以通過測量顆粒-液體界面處的電位差來反映，實際工作中以測定體系的Zeta電位值來反映[27-28]，即PF4與LMWHs混合體系中，PF4-LMWHs復合物總表面電荷可以通過測定體系的Zeta電位反映。

本文以LMWHs中應用最廣泛的Eno為研究對象，建立并驗證Zeta電位法表征PF4/Eno復合物形成的情況，為Eno仿制藥的質量評價以及提升提供一定的參考。

1 材料

Eno對照品（歐洲藥典標準品，批號：6.0）；Hp對照品（歐洲藥典對照品，批號：2.0）；Eno原研藥（商品名：克賽，北京賽諾菲制藥有限公司，規格：0.6 mL/6000 AxaIU，批號：8S313、9S14PA、AS184A）；Eno仿制藥（規格：0.6 mL/6000 AxaIU，批號：Y9200701、Y9200702、Y9200703，蘇州二葉制藥有限公司）；重組人源PF 4（批號：101543，純度：98%，Sigma-Aldrich公司）；PBS緩沖液（包含10 mmol·L-1Na2HPO4，1.75 mmol·L-1KH-2PO4，137 mmol·L-1NaCl，2.65 mmol·L-1KCl；pH 7.4；批號：B540626，上海生工生物工程股份有限公司）；ELGA超純水機（型號：PURELAB Option-S7/15，電阻率≥18.2 MΩ·cm，英國埃爾格公司）；Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀（英國Malvern Panalytical公司）。

2 方法

2.1 樣品的制備

取Eno對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋成10.00 mg·mL-1的儲備液，用超純水稀釋摩爾濃度分別為0.13、0.25、0.50、1.00和2.00 μmol·L-1的溶液。PF4用PBS緩沖液配制成128 μmol·L-1的儲備液；儲備液用超純水稀釋至4.00 μmol·L-1，現配現用。

2.2 方法的建立與驗證

2.2.1 Zeta電位測定 使用Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀，模型為Smoluchowski模型，設定溫度為25℃，平衡時間為120 s，樣品池類型為DTS1070。取1 mL待測液，并以緩慢均勻的速度注入樣品池，檢查是否除去所有氣泡，并用擦鏡紙擦干濺在外部電極的液體，將樣品池插入樣品槽中檢測。

2.2.2 孵育時間的考察 取4.00 μmol·L-1PF4溶液與0.25 μmol·L-1的Eno等體積混合均勻，室溫條件下分別孵育0、10、20、30、40、50、60 min后按“2.2.1”項下方法進行檢測，每個孵育時間點設置3個平行實驗。

2.2.3 PF4/Eno摩爾比的考察 取4.00 μmol·L-1PF4溶液分別與不同濃度的Eno溶液等體積混合均勻，使混合體系中PF4/Eno的摩爾比分別32∶1、16∶1、8∶1、4∶1、2∶1，室溫條件下孵育10 min后按“2.2.1”項下方法進行檢測，每個比例下設置3個平行實驗。

2.2.4 方法專屬性考察 取Hp對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋成10.00 mg·mL-1儲備液，用超純水將該儲備液分別稀釋成0.04、0.06、0.08、0.13和0.25 μmol·L-1的溶液。取現配的4.00μmol·L-1PF4溶液分別與上述不同濃度的Hp樣品溶液等體積混合均勻，使PF4/Hp摩爾比分別為96∶1、64∶1、48∶1、32∶1和16∶1，并于室溫條件下孵育10 min后按“2.2.1”項下方法進行檢測，每個比例設置3個平行實驗。

2.2.5 方法精密度考察 取PF4/Eno的摩爾比為16∶1，室溫條件下孵育10 min后按“2.2.1”項下方法進行檢測，儲備液配制當日、次日以及第5日分別稀釋9次后進行測定。

2.3 利用Zeta電位法比較不同批次Eno樣品對PF4電荷中和能力

取Eno樣品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋成10.00 mg·mL-1的儲備液，用超純水分別稀釋成0.13、0.25、0.40、0.50和1.00μmol·L-1的溶液。取現配的4.00 μmol·L-1PF4溶液分別與上述不同濃度的Eno樣品溶液等體積混合均勻，使PF4/Eno摩爾比分別為32∶1、16∶1、10∶1、8∶1和4∶1，并于室溫條件下孵育10 min，按“2.2.1”項下進行檢測，每個樣品設置3個平行實驗。

2.4 數據分析及統計分析

采用的數據分析軟件為Zetasizer software version 7.11（Malvern，Worcestershire，United Kingdom），統計評估軟件為Origin。將PF4/Hp（PF4/Eno）樣品復合物的Zeta數據與其摩爾比例（PHR）的對數進行S型（Logistic）方程擬合得到Sigmoidal回歸曲線，根據S型方程計算復合物表面電荷為零時的摩爾比例（PHRζ＝0）。

3 結果

3.1 方法的建立與驗證

3.1.1 孵育時間的考察 圖1顯示，混合體系的Zeta電位隨孵育時間延長有先增大后變小的趨勢?；旌象w系的Zeta電位在10～30 min內呈現增加的趨勢且整體大于15 mV，其顆粒靜電排斥力較大，復合物粒子穩定性較好，而過長的孵育時間導致復合物Zeta電位下降，呈現不穩定現象。不穩定的原因可能是由于隨著孵育時間的延長，PF4/Eno復合物粒子之間的靜電排斥力降低，以致混合體系的顆粒傾向于聚集，從而影響復合物懸浮顆粒在溶液中的電泳行為。

3.1.2 PF4/Eno摩爾比的考察 當PF4與Eno以不同的摩爾比混合時，將Zeta電位（ζ）數據與PHR的對數進行S型方程擬合得到Sigmoidal回歸曲線，見圖2，在一定的摩爾比范圍內該曲線反映Eno對PF4的電荷中和情況。

圖2 PF4分別與肝素鈉和依諾肝素鈉樣品混合體系的Zeta電位隨log PHR變化圖（n＝3）Fig 2 Change of Zeta potential of PF4 mixed with heparin and enoxaparin samples with log PHR（n＝3）

該曲線顯示隨PHR增大混合體系的Zeta電位由負向正轉變，Zeta平均電位從-（51.67±0.65）mV逐漸升高至（14.77±0.64）mV，經計算，PHRζ＝0為12.14，即PHR大約在12∶1時，PF4/Eno復合物顆粒表面凈電荷趨近零，復合物呈中性狀態。如果忽略體內外環境差異，在此摩爾比下Eno發生免疫原性的風險較高。該實驗進一步說明PF4/Eno的摩爾比對于復合物的形成至關重要。

3.1.3 方法專屬性考察 基于上述Zeta電位法方法學的考察，進一步驗證該方法測定未分級肝素對PF4的電荷中和能力，以便闡明該方法對不同肝素產品的專屬性。結果見圖2，PF4與Hp按不同比例混合，其混合體系的Zeta電位隨PF4/Hp摩爾比變化趨勢與PF4/Eno混合體系變化趨勢基本一致，即隨log PHR的增大Zeta電位由負電位向正電位轉變。PF4/Hp的混合體系電位隨著PHR的變化從-（39.37±0.96）mV逐漸升高至（10.31±0.44）mV。然而，Hp的Sigmoidal回歸曲線相對于Eno的曲線顯著向右偏移，這表明僅需要較低濃度的Hp即可中和PF4，使復合物呈中性狀態，即在相同濃度下Hp較Eno具有更高的潛在免疫原性。PF4/Eno復合物PHRζ＝0值為（12.14±0.12），PF4/Hp復合物的PHRζ＝0值為（48.25±0.60），通過t檢驗分析，兩組數據總體均數差異存在統計學意義（差值為36.11，95%CI34.80～37.43，P＜0.001）。該實驗進一步證實了Zeta電位方法能有效地應用于不同肝素類藥物對PF4的電荷中和能力的研究，以區分不同肝素類藥物的潛在免疫原性。

3.1.4 方法精密度考察 精密度結果顯示，PF4/Eno的Zeta電位分布較穩定，具有較窄的分布范圍，且重現性良好，當日和次日分別混勻測樣，Zeta電位平均值均在19 mV左右，日內精密度RSD值均小于8.0%，日間精密度RSD為8.2%，說明該方法穩定性良好。

3.2 不同批次Eno樣品對PF4的電荷中和能力的比較

在PF4/Eno的比例探索過程中，發現Zeta電位在復合物PHR為4∶1～16∶1內變化較大，因此按“2.3”項下方法調整了PF4/Eno比例。如圖3所示，原研、仿制藥Eno各3批樣品分別與PF4按不同比例混合，其混合體系的Zeta電位隨log PHR變化趨勢基本一致，Sigmoidal回歸曲線基本在同一位置，且與Hp的Sigmoidal回歸曲線有顯著性差異。經計算，PF4和3批原研Eno復合物的PHRζ＝0范圍為8.68～10.59，平均值為9.61±0.84；3批仿制藥的PHRζ＝0值范圍為8.96～9.30，通過單因素方差分析，原研藥與仿制藥差異無統計學意義，結果見表1。由此數據可以推斷該3批仿制藥與3批原研藥對PF4的電荷中和能力相當。

表1 依諾肝素鈉樣品的PHRζ＝0比較Tab 1 PHRζ＝0 of enoxaparin sodium samples

圖3 6批依諾肝素鈉樣品復合物Zeta電位隨log PHR變化的回歸曲線（n＝3）Fig 3 Sigmoidal curve of 6 batches of enoxaparin sodium samples complex Zeta potential changes with log PHR

4 討論

PF4和Eno的相互作用受動態平衡的調節，其中PF4和Eno的孵育時間以及摩爾比是影響復合物形成的重要因素。本文首先建立了Zeta電位測定PF4/Eno復合物表面電荷的方法，考察了孵育時間以及摩爾比對復合物表面電荷的影響。結果表明，PF4和Eno孵育時間不宜過長，否則影響復合物在溶液中的穩定分布。當Eno不足時，PF4/Eno復合物表面呈正電荷模式，復合物穩定分散，隨著Eno濃度的增加，PF4/Eno復合物的表面正電荷不斷被中和，當PF4/Eno的摩爾比在8～12內，復合物表面凈電荷接近零，當Eno的濃度繼續增加時，所形成的復合物表面凈電荷變為負，相互排斥作用又占主導地位，導致較小粒子又穩定分散。所以該方法可以用復合物電位與log PHR的Sigmoidal回歸曲線和PHRζ＝0值來評價和表征PF4/Eno復合物的特性。

PF4與Hp的相互作用規律與Eno類似，但是Hp對PF4的中和能力遠大于Eno，這反映了該方法能顯著區分Eno與Hp的差異，有較強的專屬性。在方法學建立和驗證的過程中所有實驗都是3個平行樣，雖然精密度的RSD值比常規的5%要略大，但相對于大分子復合物，其RSD值是可被接受的。

總體而言，表征PF4/Eno復合物的表面電荷情況是比較樣品之間免疫原性異同的重要指標之一。本文基于Zeta電位檢測建立了評價PF4/Eno復合物表面電荷情況的方法，確認了兩者的孵育時間，優化了兩者摩爾比例范圍，對比Hp明確了方法對Eno的專屬性，從跨時間和多次重復檢測的角度驗證了方法的穩定性和精密度。最后在實際應用中可以確認該方法是一個有效和可靠的從分子水平分析、對比和評價LMWHS免疫原性的方法。