左氧氟沙星聯合芪歸銀方對銅綠假單胞菌生物膜和綠膿菌素的影響

賴曉靜，李顏伶，吳珺，徐廣，劉湉，王凱赫，母磊鑫，劉清泉，馬群*（.北京中醫藥大學中藥學院，北京 0488；.北京中醫藥大學生命科學學院，北京 0488；3.首都醫科大學附屬北京中醫醫院北京市中醫研究所，中醫感染性疾病基礎研究北京市重點實驗室，北京 0000）

銅綠假單胞菌是醫院內感染中常見的革蘭氏陰性病原菌，耐藥機制復雜[1]。其中生物膜（biofilm，BF）是其典型的適應性耐藥機制之一，生物膜能幫助銅綠假單胞菌躲避人體免疫系統清除和抗菌藥物攻擊，對常用抗菌藥物產生耐藥性[2]；隨著生物膜的形成，銅綠假單胞菌的重要毒力因子綠膿菌素的分泌水平將顯著提高[3]，導致細菌的致病性和感染性增強[4-5]，病情遷延反復[6]，給臨床治療帶來了極大的挑戰。

隨著臨床單用抗菌藥物治療生物膜感染的效果越來越不盡如人意，聯合用藥的給藥策略獲得了廣泛的認可[6-8]。多項研究表明抗菌藥物聯合中藥能有效抑制生物膜耐藥機制，提高療效[9-11]。芪歸銀方（Qiguiyin decoction，QGYD）由黃芪、金銀花、當歸、青蒿、虎杖5味中藥配伍組成，聯合廣譜抗菌藥物使用具有良好的抗感染效果[11-12]，目前關于QGYD干預銅綠假單胞菌生物膜形成的研究還未見報道。本論文基于提取物和含藥血清兩個層次，研究芪歸銀方（QGYD）聯合左氧氟沙星（LEV）對敏感/耐藥銅綠假單胞菌生物膜和綠膿菌素的影響，為中藥聯合抗菌藥物防治生物膜感染的臨床用藥提供參考。

1 材料

1.1 菌株來源

標準銅綠假單胞菌ATCC27853一代菌株（編號：BNCC337940，北京北納創聯生物技術研究院）；多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株（樣本號：19PXSP2218，北京中醫藥大學東直門醫院檢驗科）。

1.2 試藥

中藥飲片黃芪600 g、金銀花150 g、當歸100 g、青蒿150 g、虎杖100 g（批號分別為90541102、93451002、90280901、93051001、90510501，北京三和藥業有限公司），經北京中醫藥大學楊瑤君教授鑒定均為正品。左氧氟沙星對照品（批號：Y02N7C23971，HPLC≥99%，上海源葉生物技術有限公司）。左氧氟沙星片[批號：BX00A1，第一三共制藥（北京）有限公司]。

M-H瓊脂、M-H肉湯（青島高科技工業園海博生物技術有限公司，批號分別為20210124、20201202）；0.4%草酸銨結晶紫染液（批號：R20710）、2.5%戊二醛固定液（批號：L26O11G12-8919）、氯化鎂、甘油、硫酸鉀（分析級，上海源葉生物技術有限公司）；蛋白胨（批號：20190102，北京博奧拓達科技有限公司）；濃鹽酸，氯仿（分析級，北京中醫藥大學危化品管理倉庫）。

1.3 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠80只，體重240～280 g，許可證號：SCXK（京）2016-0006，動物批號：No.111011211101075631，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，飼養于北京中醫藥大學動物房，飼養條件為恒溫（24±2）℃，相對濕度為40%～70%，12 h 光照和黑暗循環模擬正常晝夜周期。動物實驗經北京中醫藥大學動物倫理委員會批準（No.4-2021113001-4079）。

1.4 儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（型號：YXQ-100A，上海博迅實業有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（型號：DHG-9070A，上海一恒科學儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（型號：HH-S6，北京科偉永興儀器有限公司）；高速冷凍離心機[型號：Sorvall ST 8R，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司]；生物安全柜[型號：1374，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司]；氣浴恒溫振蕩儀（型號：ZD-85，濟寧市翰業機械設備有限公司）；微生物可編程培養箱[型號：LT-IBX120N，立德泰勊（上海）科學儀器有限公司]；酶標分析儀（型號：DNM-9602，北京朗新技術有限公司）。

2 方法與結果

2.1 藥物的制備

2.1.1 藥液的制備 采用課題組前期工藝優化選定的提取方法[13]制備生藥質量濃度為2 g·mL-1的QGYD藥液。參照臨床和實驗室標準化協會（CLSI）（2019版）文件配制LEV對照品儲備液，無菌分裝-20℃凍存。課題組前期體外抑菌研究表明，單用LEV對照品藥液對銅綠假單胞菌標準菌株（ATCC27853）和耐藥菌株（19PXSP2218）的MIC分別為0.8 μg·mL-1、8 μg·mL-1；參照CLSI（2019版）中的二倍稀釋法，用MHB培養基將LEV對照品溶液稀釋至2、1、1/2、1/4、1/8 最低抑菌濃度（MIC）。根據QGYD臨床人日處方量（110 g生藥/60 kg）和LEV臨床人日處方量（0.6 g/60 kg），用MHB培養基將2 g·mL-1的QGYD藥液配制得293.3、146.7、73.3、36.7 μg·mL-1或2933.3、1466.7、733.3、366.7 μg·mL-1的QGYD藥液。依次將LEV（除1/8MIC）和QGYD藥液從高濃度到低濃度配對等體積混合，制備LEV+QGYD組藥液。LEV組藥液LEV終質量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 μg·mL-1或1.0、2.0、4.0、8.0 μg·mL-1（1/8、1/4、1/2、1MIC），LEV+QGYD組藥液LEV終質量濃度同LEV組，QGYD終質量濃度分別為146.7、73.3、36.7、18.3 μg·mL-1（或1466.7、733.3、366.7、183.3 μg·mL-1）。

2.1.2 含藥血清的制備 Wistar雄性大鼠80只，隨機分為4組，分別是LEV組、QGYD組、LEV+QGYD組和空白對照組，每組20只。根據LEV說明書日給藥劑量、QGYD臨床日給藥劑量和大鼠等效劑量系數折算，LEV組大鼠LEV給藥劑量為0.0625 g/（kg·d）；QGYD組大鼠QGYD給藥劑量為11.5 g/（kg·d）；LEV+QGYD組大鼠LEV給藥劑量為0.0625 g/（kg·d），QGYD給藥劑量為11.5 g/（kg·d）；空白對照組大鼠灌胃等劑量的生理鹽水，每日2 次，連續5 d。

末次給藥前12 h禁食不禁水，灌胃后1 h經腹主動脈無菌手法采血，4℃離心分離血清（2500 r·min-1，20 min），同組血清混合，56℃水浴30 min滅活，-80℃保存。課題組前期血清藥理學研究表明，LEV組含藥血清對銅綠假單胞菌標準菌株和耐藥菌株的MIC90依次為15%、55%[14]。用MHB培養基分別將各組血清稀釋到1MIC后，采用二倍稀釋法制備1/2、1/4、1/8MIC的含藥血清，血清終濃度為1.9%、3.8%、7.5%、15.0%或6.9%、13.8%、27.5%、55.0%（1/8、1/4、1/2、1MIC）。

2.2 銅綠假單胞菌生長曲線的測定

吸取0.5 MCF 銅綠假單胞菌（ATCC27853）或耐藥菌株（19PXSP2218）菌液加入藥液或含藥血清（1/8、1/4、1/2、1MIC）中，充分吹打混勻。吸取200 μL加入96孔板中，每孔銅綠假單胞菌菌濃度為1.5×106CFU·mL-1，各濃度設置4個平行孔，同時設置同稀釋比例陰性對照孔（藥液/血清）、MHB肉湯培養基陽性對照孔、MHB肉湯培養基陰性對照孔。將96孔板置于恒溫震蕩搖床中37℃、220 r·min-1培養24 h。每間隔1 h用酶標儀測定96孔板液體在波長600 nm下的吸光度值（A），重復以上實驗3次。結果見圖1、2。藥液部分結果表明，與陽性對照組相比，當LEV藥物濃度為1、1/2、1/4、1/8MIC時，LEV組和LEV+QGYD組銅綠假單胞菌（標準/耐藥）24 h生長量均明顯降低，銅綠假單胞菌（標準/耐藥）的生長均被明顯抑制。與LEV組相比，LEV聯用QGYD后對銅綠假單胞菌（標準 /耐藥）的抑制作用無明顯變化。血清部分結果表明，當血清濃度為1、1/2、1/4、1/8MIC時，與陽性對照組相比，LEV組、QGYD組、LEV+QGYD組和空白對照組銅綠假單胞菌標準菌株生長量均明顯降低。血清濃度為1/2MIC時，LEV聯用QGYD后對銅綠假單胞菌標準菌株的抑制作用增強。與陽性對照組相比，當血清濃度為 1、1/2MIC時，LEV組、QGYD 組、LEV+QGYD組銅綠假單胞菌耐藥菌株生長量均明顯降低；當血清濃度為1/4、1/8MIC時，LEV組銅綠假單胞菌耐藥菌株生長量明顯提高。與LEV組相比，當血清濃度為1/2、1/4MIC時，LEV聯用QGYD后對銅綠假單胞菌耐藥菌株的抑制作用增強，血清濃度為1/8MIC時，LEV聯用QGYD后對銅綠假單胞菌耐藥菌株的抑制作用呈增強的趨勢。

圖1 藥液對銅綠假單胞菌菌株生長的影響（±s，n＝4）Fig 1 Effect of liquid medicine on the growth of Pseudomonas aeruginosa strains（±s，n＝4）

圖2 含藥血清對銅綠假單胞菌菌株生長的影響（±s，n＝4）Fig 2 Effect of medicated serum on the growth of Pseudomonas aeruginosa strains（±s，n＝4）

2.3 結晶紫染色法測定銅綠假單胞菌生物膜形成量

參照“2.1”項下方法制備藥液和含藥血清。吸取0.5 MCF 銅綠假單胞菌（ATCC27853）或耐藥菌株（19PXSP2218）菌液加入藥液或含藥血清（1/8、1/4、1/2、1MIC）中，充分吹打混勻。吸取200 μL加入96孔板中，每孔銅綠假單胞菌濃度為1.5×106CFU·mL-1，各濃度設置4個平行孔，同時設置MHB肉湯培養基陽性對照孔、MHB肉湯培養基陰性對照孔。將96孔板置于恒溫培養箱中37℃培養24 h（銅綠假單胞菌 ATCC27853）或48 h（耐藥菌株19PXSP2218）。取出96孔板，小心倒掉孔內菌液，生理鹽水洗滌2次。加入200μL的2.5%戊二醛固定20 min（避光），生理鹽水洗滌2次。加入 200 μL 的 0.4%結晶紫染色液染色15 min（避光），生理鹽水清洗3～4次。96孔板室溫下避光放置干燥，待孔內無明顯液體，加入200 μL 95%乙醇脫色溶解10 min，用酶標儀測定96孔板液體595 nm波長下A值，結果如圖3所示。

藥液部分結果顯示，與陽性對照組相比，1MIC的LEV組、LEV+QGYD組銅綠假單胞菌標準菌株生物膜形成量顯著減少。與LEV組相比，LEV+QGYD組（1、1/2、1/4、1/8MIC）銅綠假單胞菌標準菌株生物膜形成量無減少的趨勢。與陽性對照組相比，LEV組（1、1/2、1/4MIC）和LEV+QGYD組（1、1/2、1/4、1/8MIC）銅綠假單胞菌耐藥菌株生物膜形成量均顯著減少。與LEV組相比，LEV+QGYD組（1/2、1/4、1/8MIC）銅綠假單胞菌耐藥菌株生物膜形成量均明顯減少。

血清部分結果顯示，與陽性對照組相比，血清濃度為1、1/2MIC的LEV組、QGYD組和空白對照組銅綠假單胞菌標準菌株生物膜形成量均明顯減少。與LEV組相比，當血清濃度為1/2、1/4MIC時，LEV+QGYD組銅綠假單胞菌標準菌株生物膜形成量明顯減少。與陽性對照組相比，當血清濃度為1、1/2MIC時，QGYD組、LEV+QGYD組和空白對照組銅綠假單胞菌耐藥菌株生物膜形成量明顯減少。與陽性對照組相比，LEV組（1MIC）銅綠假單胞菌耐藥菌株生物膜形成量明顯減少，LEV組（1/8MIC）生物膜形成量明顯增加。與LEV組相比，LEV+QGYD組（1、1/2、1/4、1/8MIC）、QGYD組（1/2、1/4MIC）和空白對照組（1/2、1/4MIC）銅綠假單胞菌耐藥菌株生物膜形成量明顯減少。

2.4 氯仿萃取法測定銅綠假單胞菌的綠膿菌素含量

參照上述方法，用PDP培養基（不含瓊脂）替代MHB培養基稀釋藥液和含藥血清后，吸取0.5 MCF 銅綠假單胞菌（ATCC27853）或銅綠假單胞菌（19PXSP2218）菌液加入藥液或含藥血清（終濃度為1/8、1/4、1/2、1MIC）中，充分吹打混勻，每支搖菌管中銅綠假單胞菌菌濃度為1.5×106CFU·mL-1，體系為1 mL。將搖菌管放入恒溫震蕩搖床37℃、220 r·min-1培養24 h。實驗設置陽性對照組和陰性對照組，每組設5個平行（血清3個平行），重復實驗 3 次。吸取 860μL 的含菌液體加入到1.5 mL的離心管中，12 000 r·min-1離心1 min。吸取800 μL上清液轉移至2 mL的離心管中，加入800 μL的氯仿，渦旋混勻后，4500 r·min-1離心 10 min，可觀察到液體分層，上層為淡黃色，下層由無色變為淡藍色或藍綠色。吸取700 μL下層液體移至1.5 mL的離心管中，并加入140 μL的0.2 mol·L-1稀鹽酸，渦旋混勻后，4500 r·min-1離心10 min。可觀察到液體分層，上層液體由無色轉為粉色或紫紅色，下層液體變為無色。吸取100 μL上層液體加入96孔板，用酶標儀檢測520 nm波長下吸光度值。結果如圖4所示。

圖4 藥液（A）和含藥血清（B）對銅綠假單胞菌標準菌株（ATCC27853）和耐藥菌株（19PXSP2218）綠膿菌素的影響Fig 4 Effect of liquid medicine（A）and medicated serum（B）on the secretion of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa standard strain（ATCC27853）and drug-resistant strain（19PXSP2218）（±s，n＝5）

藥液部分結果表明，當LEV藥物濃度為1、1/2、1/4、1/8MIC時，與陽性對照組相比，LEV組和LEV+QGYD組銅綠假單胞菌標準菌株綠膿菌素分泌量均明顯減少。當LEV藥物濃度為1/2、1/4MIC時，LEV聯用QGYD后抑制銅綠假單胞菌標準菌株綠膿菌素產生的作用明顯增強。與陽性對照組相比，LEV組（1、1/2、1/4MIC）和LEV+QGYD組（1、1/2、1/4、1/8MIC）銅綠假單胞菌耐藥菌株綠膿菌素分泌量均明顯減少。與LEV組相比，當LEV濃度為1/2MIC時，LEV聯用QGYD后抑制銅綠假單胞菌耐藥菌株產生綠膿菌素的作用明顯增強。

血清部分結果表明，與陽性對照組相比，當血清濃度為1、1/2、1/4MIC時，QGYD組、LEV+QGYD組和空白對照組銅綠假單胞菌標準菌株綠膿菌素分泌量明顯減少。與陽性對照組相比，LEV組（1、1/2MIC）銅綠假單胞菌標準菌株綠膿菌素分泌量明顯減少；LEV組（1/4MIC）無明顯變化；LEV組（1/8MIC）綠假單胞菌標準菌株綠膿菌素分泌量增加。與LEV組相比，LEV+QGYD組（1/2、1/4MIC）和QGYD組（1/4、1/8MIC）銅綠假單胞菌標準菌株綠膿菌素分泌量均明顯減少，空白對照組（1、1/2、1/4、1/8MIC）無明顯變化。當血清濃度為1、1/2、1/4、1/8MIC時，與陽性對照組相比，LEV組、QGYD組、LEV+QGYD組和空白對照組銅綠假單胞菌耐藥菌株綠膿菌素分泌量均明顯減少。與LEV組相比，當血清濃度為1/8MIC時，LEV+QGYD組、QGYD組和空白對照組銅綠假單胞菌耐藥菌株綠膿菌素分泌量均明顯減少。

2.5 大鼠含藥血清中LEV濃度的測定

本研究沿用課題組前期確定的 UPLC-MS/MS測定大鼠含藥血清中LEV的濃度[14]。用甲醇作溶劑制備80、40、20、10、4、2、1、0.4μg·mL-1的LEV系列對照溶液，同時制備環丙沙星（20 μg·mL-1）內標溶液。取空白血清20 μL，分別加入LEV系列溶液和內標溶液（20μg·mL-1）各5 μL，加入50 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋1 min，4℃離心15 min（14 000 r·min-1），取上清液，氮氣吹干后加入1 mL初始比例的流動相復溶，渦旋30 s，4℃離心15 min（14 000 r·min-1）取上清液，進樣1 μL分析測定，含藥血清用相同方法處理并進樣分析。

① 色譜條件：Waters Acquity TMUPLC色譜柱ACQUITYCSHC18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流速0.3 mL·min-1，樣品室溫度10℃，柱溫40℃，進樣體積1 μL。流動相0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～0.1 min，90%→85%A；0.1～3.0 min，85%→20%A；3.0～3.5 min，20%→90%A。② 質譜條件：Waters三重四極桿串聯質譜儀，采用電噴霧離子源，正離子檢測模式，離子對選擇LVFXm/z362.2395～261.1767，錐孔電壓44 V，碰撞能量22 eV；CPFXm/z332.1651～245.1919，錐孔電壓42 V，碰撞能量20 eV。毛細管電壓2.5 kV，離子源溫度150℃，去溶劑氣溫度350℃，去溶劑氣流速650 L·h-1，多反應監測模式檢測。測得LEV在大鼠血清中標準曲線方程為y＝0.057 97x+0.1266（r＝0.9991）。LEV在 2～400 ng·mL-1與峰面積線性關系良好。含藥血清中LEV的質量濃度結果如表1所示。

表1 含藥血清中左氧氟沙星的藥物濃度(n＝6)Tab 1 Concentration of levofloxacin in the serum with drug (n＝6)

2.6 大鼠血清中 TNF-α和 IL-2 的測定

測定結果見表2，與空白對照組相比，LEV組TNF-α表達水平明顯升高，IL-2表達水平無明顯變化；QGYD組、QGYD聯合LEV組TNF-α和IL-2均無明顯變化。與LEV組相比，QGYD聯合LEV組TNF-α和IL-2表達水平均明顯降低。

表2 含藥血清中TNF-α和IL-2表達水平(n＝5，ng·mL-1)Tab 2 TNF-α and IL-2 expression in the serum with drug (n＝5，ng·mL-1)

2.7 數據處理

采用SPSS Statistics 21.0、GraPhPad Prism 8.0.1分別進行數據統計和作圖，計量資料采用±s表示，符合正態分布且方差齊時采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t法，符合正態分布但方差不齊時采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett-T3法，對不符合正態分布的計量資料采用非參數檢驗。

3 討論

LEV是一種氟喹諾酮類抗菌藥物，具有廣譜和強效的抗菌特點，對銅綠假單胞菌的抗菌活性顯著，中國成人社區獲得性肺炎和治療指南中推薦LEV與其他藥物聯合用于臨床上耐藥銅綠假單胞菌感染的治療。目前國內外關于中藥聯合抗菌藥物對細菌生物膜和綠膿菌素影響的研究多為體外研究[15-18]，但中藥復方復雜的成分和理化性質，會對體外抑菌實驗形成干擾，影響研究結果的準確性和科學性[19-20]。血清藥理學為中藥復方提供了新的思路[21]，中藥含藥血清不受無機鹽、鞣質等化學成分，滲透壓和pH值等物理因素的影響，更符合中藥在體內代謝的實際情況，有利于中藥復方的藥效及作用機制研究[22-23]。本文針對銅綠假單胞菌標準菌株和耐藥菌株兩種菌株，基于QGYD中藥提取物和含藥血清兩個層次開展生物膜和綠膿菌素的研究，同時實驗測得LEV組與LEV+QGYD組血清中LEV含量相近（分別為6.14 μg·mL-1和5.12 μg·mL-1），避免了聯用組血清中抗菌藥物濃度高于單用組血清影響實驗結果的現象，同時本研究測定了各組大鼠血清中炎癥因子的表達量，探索QGYD增敏LEV的作用機制，可為中藥聯合抗菌藥物防治生物膜感染的研究提供參考。

本文基于體外和半體內兩個層次對LEV聯合QGYD對銅綠假單胞菌生物膜和綠膿菌素的影響進行研究，體外實驗表明：LEV組和LEV+QGYD組藥液均能抑制銅綠假單胞菌（標準/耐藥）的生長；LEV組、LEV+QGYD組藥液對銅綠假單胞菌（標準/耐藥）生物膜的形成、綠膿菌素分泌量均具有一定的抑制作用，LEV聯用QGYD后抑制作用增強。含藥血清實驗表明：LEV組、LEV+QGYD組血清均能抑制銅綠假單胞菌（標準/耐藥）的生長，LEV+QGYD后對銅綠假單胞菌（標準/耐藥）的抑制作用增強；LEV組、LEV+QGYD組均能抑制銅綠假單胞菌（標準/耐藥）生物膜的形成和綠膿菌素的分泌，LEV聯用QGYD后抑制作用增強。體外和含藥血清研究結果趨勢一致，互相支持。進一步表明了聯合QGYD能增強LEV的抗菌活性，有效抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成和綠膿菌素的分泌，為中藥與抗菌藥物聯用防治細菌生物膜耐藥提供可靠的科學依據。本論文采用 ELISA 分子生物學技術測定LEV單用及聯用QGYD時大鼠血清免疫因子的變化，結果表明QGYD增強LEV抗菌活性的作用可能與免疫因子相關。課題組前期研究證實，QGYD能通過下調TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路關鍵基因和蛋白的表達，調控TNF-α、IL-6、IL-12等炎性因子的表達，減輕炎癥反應紊亂，維持機體免疫平衡[12]，本實驗與前期研究相一致。

本文基于藥效學研究探討中藥與抗菌藥物聯用防治細菌生物膜耐藥的作用，并進行相關機制初探，后期會繼續探討中藥與抗菌藥物聯用防治細菌生物膜耐藥的作用機制，為臨床給藥方案的優化提供支持。