基于網絡藥理學的余甘子有效部位調控巨噬細胞極化機制研究

陳尹心，常子豪，胡倩，劉宇琦，高曄，黃雅，雒曉衛，王樹楷，周立鵬，王保錦，王朝慧，崔藝彤，劉越，張蘭珍（北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488）

腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是腫瘤微環境中最豐富的免疫細胞。一般來說，在不同生理病理因素刺激下，巨噬細胞可分化成兩種極化狀態，即經典活化的M1型和替代活化的M2型。其中，M1型參與促炎反應的同時也發揮抗腫瘤活性，而M2型則參與抗炎反應，并能通過腫瘤免疫抑制等作用促進腫瘤發展。調控M2型巨噬細胞向M1型極化能夠增強腫瘤免疫反應、抑制腫瘤生長、轉移和腫瘤血管生成[1]。因此，調控腫瘤相關巨噬細胞極化已經成為一種多機制、多功能的高效免疫治療策略。

余甘子為大戟科葉下珠屬植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的干燥成熟果實，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳之功效[2]。現代研究表明，余甘子主要含有酚酸類、鞣質類成分。課題組前期研究發現余甘子鞣質在體外能誘導人肝癌細胞BEL-7402早期凋亡和G2/M期阻滯[3]，通過調節MAPK通路，降低MPPs的表達，誘導腫瘤細胞凋亡[4]。臨床研究表明余甘子鞣質具有潛在的免疫調節作用[5]。但其是否具有重塑免疫抑制微環境抑制腫瘤生長的作用以及其物質基礎和作用機制尚不清楚。因此，本研究以M2型巨噬細胞為對象篩選抑制M2型巨噬細胞極化調節腫瘤微環境的余甘子活性部位，并結合UPLC-Q-Exactive-MS/MS技術和網絡藥理學分析其物質基礎和作用機制。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀和Q-Exactive 高分辨質譜儀、CO2細胞培養箱、超低溫冰箱（Thermo Scientific 公司）；十萬分之一分析天平（Sartorius公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；超凈工作臺（北京半導體設備一廠）；DT5-6A 型臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；PCR 擴增儀（德國 Eppendorf 公司）；QuantStudio 6 Flex 實時熒光定量 PCR 儀（CFX 96，Biorad 公司）。

1.2 試藥

乙腈、甲酸（質譜純，Thermo Fisher 公司）；蒸餾水[屈臣氏集團（香港）有限公司]；MCI小孔吸附樹脂（日本三菱化學公司）；胎牛血清、DMEM培養基（Biological Industries公司）；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒以及 SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；重組小鼠白細胞介素-4（IL-4）、重組小鼠白細胞介素-13（IL-13）（PeproTech公司）；余甘子鞣質部位（江西青峰藥業有限公司）。

1.3 細胞

小鼠 RAW264.7 單核巨噬細胞（北京協和細胞庫）凍存于北京中醫藥大學中藥學院細胞平臺。細胞復蘇后在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養。

2 方法與結果

2.1 余甘子鞣質不同洗脫部位對RAW264.7細胞活性的影響

2.1.1 樣品的制備 取余甘子鞣質部位（鞣質含量58%），加去離子水使溶解，經MCI小孔樹脂柱色譜吸附，依次用不同濃度的甲醇（20%、30%、40%、50%、100%）梯度洗脫，每步洗脫至洗脫液近無色時更換為下一洗脫梯度。合并相同洗脫液，低溫濃縮，干燥成粉。

2.1.2 CCK-8法檢測細胞增殖 將RAW264.7細胞鋪于96孔板中，用不同濃度的不同余甘子鞣質洗脫部位（5、10、20、40、80、160、320 μg·mL-1）100 μL培養24 h后，加入CCK-8試劑，檢測各孔吸光度值（OD值），計算細胞存活率：細胞存活率（%）＝（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。結果見圖1，當藥物質量濃度≤40 μg·mL-1，對RAW264.7細胞存活率均在85%以上，無明顯抑制作用，說明質量濃度≤40 μg·mL-1時對巨噬細胞無明顯細胞毒作用。因此，本研究選取40 μg·mL-1的濃度用于后續對不同洗脫部位篩選的研究。

圖1 不同質量濃度的余甘子鞣質對巨噬細胞活性的影響（n＝3）Fig 1 Effect of different concentration of tannins in Phyllanthus emblica L.on the proliferation of RAW264.7 cells（n＝3）

2.1.3 qPCR實驗檢測M2巨噬細胞中Arg-1、CD206、TNF-αmRNA表達 將RAW264.7細胞接種于12孔板中，不進行M2型誘導的為空白組（ctrl組）、用IL-4和IL-13誘導而不給藥干預的為M2組，用IL-4和IL-13誘導后余甘子鞣質不同洗脫部位干預24 h為給藥組，收集細胞，提取RNA，逆轉錄cDNA，進行qPCR檢測。設計合成Arg1、CD206、TNF-α基因引物，以Hprt1為內參，設置反應程序，目標基因的表達水平用2-ΔΔCt比較法進行評估，結果見圖2。模型組RAW264.7細胞表達更高水平的Arg-1和CD206（P＜0.05，P＜0.0001），表明IL-4和IL-13作用后成功誘導巨噬細胞向M2型極化。各個洗脫部位對M2型標志基因的mRNA表達均有一定的抑制作用。除100%甲醇洗脫部位外，不同的洗脫部位對Arg-1的表達均有抑制作用，其中20%甲醇洗脫部位具有極顯著的抑制作用（P＜0.001）。同樣的，20%甲醇洗脫部位顯著降低CD206mRNA的表達，升高TNF-αmRNA的表達（P＜0.001），其調控巨噬細胞極化的活性明顯強于其他洗脫部位，是余甘子鞣質調控巨噬細胞極化的主要活性部位（EFP）。因此，接下來對20%甲醇洗脫部位所含化學成分進行進一步研究。

圖2 余甘子鞣質不同洗脫部位對M2巨噬細胞極化的影響（n＝3）Fig 2 Effect of different elution parts of tannins in Phyllanthus emblica L.on the polarization of M2 macrophages（n＝3）

2.1.4 統計學方法 結果采用Graphpad prism 8.4.3軟件進行統計分析，各組間的比較采用單因素方差分析，所有數據以平均值±標準差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2.2 UPLC-Q-Exactive-MS/MS分析條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ACE Excel 3 C18-PFP（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，6%～12%B；3～18 min，12%～20% B；18～28 min，20%～30%B；28～30 min，30%B；30～34 min，30%～95%B）；流速：0.5 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：30℃。

2.2.2 質譜條件 配有熱噴霧離子源（HESI），負離子模式檢測，離子源參數設置如下：毛細管和輔助氣體加熱器溫度分別為300和350℃；噴霧電壓為3.2 kV；鞘氣（N2）流量為35 arb，輔助氣體（N2）流量為15 arb。歸一化碰撞能量（NCE）為±35 V。在Full-MS/dd-MS2條件下，掃描范圍為m/z100～1500。采用 Xcalibur 3.0 軟件進行數據分析。

2.2.3 20%甲醇洗脫部位化學成分分析 采用上述分析條件，對20%甲醇洗脫部位的化學成分進行定性分析。在負離子模式下20%甲醇洗脫部位總離子流圖如圖3所示。通過參考相關文獻[6-14]、對比保留時間、精確質譜信息等，對EFP的化學成分進行確認，鑒定出 29個可能的化學成分，包括7個酚酸類、12個簡單沒食子酰類、9個鞣花鞣質類、1個其他類。UPLC-Q-Exactive-MS/MS 數據見表1。

表1 EFP化學成分結構鑒定Tab 1 Structure identification of chemical components in EFP

圖3 負離子模式下20% 洗脫部位的總離子流圖Fig 3 Total ion flow chromatogram of 20% methanol eluted part in negative ion mode

2.2.4 化合物分析

① 酚酸類：共鑒定出7個酚酸類化合物成分。酚酸類化合物是一類含酚環的有機酸，含有較多的酚羥基和羧基，其質譜裂解特點是容易失去H2O、CO2和CO等基團。化合物9的保留時間是7.30 min，準分子離子峰為m/z169.0142 [M-H]-，分子式為C7H6O5。經碰撞解離，失去一個CO2產生碎片m/z125.0254 [M-H-CO2]-，結合文獻[7]推測為沒食子酸；化合物29的保留時間為24.49 min，準分子離子峰為m/z300.9993 [M-H]-，分子式為C14H6O8。經碰撞產生二級碎片m/z283.9963 [M-HOH]-；或失去一個CO2產生碎片m/z257.0081[M-H-CO2]-，再失去一個CO產生229.0145 [M-HCO2-CO]-，再失去CO產生201.0200 [M-H-CO2-2CO]-，結合文獻[7]推測該化合物為鞣花酸。

② 簡單沒食子酰類：共鑒定出12個簡單沒食子酸酰類化合物成分。簡單沒食子酸酰類化合物主要為沒食子酸衍生物，較易脫去沒食子酰基（-galloyl）。化合物14、20的保留時間分別為9.42 min、11.95 min，準分子離子峰分別為m/z483.0782 [M-H]-、m/z483.0780 [M-H]-，擬合分子式均為C20H20O14，兩者為同分異構體，裂解方式相同。以化合物20為例，該化合物經碰撞失去一個沒食子酰基，得到m/z331.0677 [M-HGal]-，再失去一個H2O得到m/z313.0566 [M-HGal-H2O]-，失去一個中性碎片C4H8O4得到m/z211.0252[M-H-Gal-C4H8O4]-，或失去一分子葡萄糖得到m/z169.0149 [M-H-Gal-Glu]-，再失去一個CO2得到m/z125.0251 [M-H-Gal-Glu-CO2]-，結合文獻[8]推測該化合物為二沒食子酰葡萄糖苷digalloylglucose。

③ 鞣花鞣質類：共鑒定出9個鞣花鞣質類成分。鞣花鞣質是一類含六羥基聯苯二酸或與其有生源關系的酚羧酸與多元醇縮合形成的酯，較易失去六羥基二苯甲酰基（HHDP）基團、沒食子酰基，水解后可生成鞣花酸。余甘子中主要含有的與HHDP有生源關系的酚羧酸酰基主要是訶子酰基（Che）。化合物 27 的保留時間為16.61 min，準分子離子峰為m/z633.0743 [M-H]-，擬合分子式為 C27H22O18，脫去一個沒食子酸，得到m/z463.0520，該碎片再丟失一分子葡萄糖（glu），得到m/z300.9993 [M-HGal-Glu]-，繼續失去CO2得到m/z257.0089 [M-HGal-H2O-Glu-CO2]-，再脫去CO得到m/z229.0154[M-H-Gal-H2O-Glu-CO2-CO]-，沒食子酸自母離子脫去產生特征碎片離子m/z169.0150 [gallic acid]-，結合文獻[14]推測其為柯里拉京。

2.3 網絡藥理學

2.3.1 活性成分的篩選及靶點的預測 將液質鑒定出的化合物輸入SwissADME平臺（http：//www.swissadme.ch/），以胃腸道吸收得分為“high”，類藥性至少通過2個“Yes”進行篩選，并結合課題組前期研究[6]余甘子鞣質入血成分獲得潛在化合物。共篩選出11種活性成分，分別為鞣花酸、沒食子酸乙酯、沒食子酸甲酯、沒食子酸、柯里拉京、1，4，6-tri-O-galloyl-glucose、3，4，6-tri-O-galloyl-glucose、mucic acid 2-O-gallate、訶子次酸、特里馬蘇I、訶子寧。在SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數據庫中預測不同成分的靶點基因，篩選probability＞0的靶點，得到成分的預測靶點。從GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中查找并篩選差異表達基因，將巨噬細胞差異靶點基因與20%甲醇洗脫部位相關成分預測靶點進行比對，取交集作為潛在靶點基因。結果預測得94個靶點基因。從GEO數據庫中下載編號為GSE5099的人類基因芯片，通過GEO2R功能以P＜0.05且|log2FC|＞0.5為標準，篩選去重后得到巨噬細胞相關的靶點共5391個。對活性成分信息和巨噬細胞相關靶點進行分析，得到交集靶點37個，將其視為20%甲醇洗脫部位調控巨噬細胞的潛在靶點。

2.3.2 “藥物成分-潛在靶點”網絡的構建 利用Cytoscape 3.7.2軟件的“Merge”工具構建“藥物成分-潛在靶點-巨噬細胞”網絡（見圖4），共包括49個節點，126條邊。根據度值排序得到主要的活性成分為鞣花酸、沒食子酸甲酯、1，4，6-tri-O-galloyl-glucose、沒食子酸、沒食子酸乙酯等；這些成分作用的靶點有高角鯊烯環氧化酶（SQLE）、蛋白質酪氨酸磷酸酶1（PTPN1）、β分泌酶1（BACE1）、蛋白質酪氨酸磷酸酶2（PTPN2）、重組人醛糖還原酶（AKR1B1）等，揭示其或許與余甘子鞣質調控巨噬細胞的過程密切相關。

圖4 20%甲醇洗脫部位調控巨噬細胞細胞的“藥物成分-潛在靶點”網絡Fig 4 Network of “component-potential target” of 20% methanol eluted part

2.3.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建與分析 在 STRING 平臺（https：//STRING-db.org/）輸入交集靶點，限定物種為“智人”，獲得PPI 網絡。利用 Cytoscape 3.7.2 軟件，對 PPI 網絡進行可視化操作。結果見圖5，通過 Network Analyzer 插件分析其拓撲學特征，篩選關鍵靶點主要為絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT1）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、和酪氨酸專一性蛋白激酶（Src）、前列腺素過氧化物合成酶 2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）、糖原合成酶激酶（GSK3B）等。

圖5 交集靶點PPI網絡Fig 5 PPI network of potential targets

2.3.4 靶點功能富集分析與網絡構建 通過Sangerbox平臺（http：//sangerbox.com/）對交集靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并對排名前 20 的通路進行結果可視化。

對37個交集靶點進行 GO 功能富集分析（P＜0.05），共獲得 2438個 GO 條目，包括生物過程（BP）條目 2096個、細胞組成（CC）條目 146個、分子功能（MF）條目 196個，對排名前 10 的各類GO條目進行可視化處理，結果見圖6A。BP主要涉及對有機物的反應、對含氧化合物的反應、對化學刺激的細胞反應等；CC主要涉及囊泡、膜筏、膜微區等；MF主要涉及一氧化氮合酶活性、酶結合、激酶結合等。

圖6 GO富集分析條形圖（A）和KEGG富集分析氣泡圖（B）Fig 6 GO enrichment analysis（A）and KEGG pathways enrichment analysis（B）of potential targets

KEGG富集相關通路76條（P＜0.05），對排名前20的通路進行可視化展示（見圖6B），包括EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥信號通路、缺氧誘導因子1信號通路、癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-kappaB信號通路等。

3 討論

精氨酸酶-1（Arg-1）和甘露糖受體（CD206）是M2巨噬細胞的識別標志物。Arg-1與iNOS競爭L-精氨酸作為底物，生成膠原蛋白前體L-鳥氨酸，形成促進腫瘤生長的纖維化微環境[15]。此外，Arg-1通過代謝L-精氨酸直接影響CD8+T細胞[16]，CD206可通過抑制CD45磷酸酶活性損害CD8+T細胞的細胞毒性[17]，導致腫瘤細胞免疫逃逸。因此，本研究利用M2型RAW264.7細胞模型篩選出余甘子鞣質20%甲醇洗脫部位，發現其能夠顯著抑制M2型巨噬細胞識別標志物Arg-1、CD206的表達，同時促進M1型標志物TNF-α，提升其抗腫瘤免疫活性。

利用UPLC-MS分析20%甲醇洗脫部位定性鑒別出29個化學成分，主要為酚酸類化合物和鞣質類化合物。進一步根據課題組前期研究[6]和SwissADME平臺獲得11個活性成分進行網絡藥理學分析。“藥物成分-潛在靶點”網絡圖中度值靠前的成分分別有沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯等。毛赫新等[18]發現沒食子酸能夠降低M1型巨噬細胞陽性表達率，抑制iNOS和IL-1βmRNA表達水平，抑制IFN-γ/LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞向M1型的極化。柯里拉京可以通過抑制IL-13Ralpha1信號通路抑制M2巨噬細胞極化[19]。此外，鞣花酸通過ERK1/2/RSK信號通路抑制腫瘤細胞功能[20]，沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯能夠通過抑制腫瘤細胞中Akt和ERK1/2活性、ERK1/2/RSK信號通路來發揮抗腫瘤作用[21-22]，但對于這些成分的研究主要集中在對腫瘤細胞的直接作用，對其抗腫瘤免疫的作用卻鮮有報道。

通過KEGG富集分析可推斷，20%甲醇洗脫部位調控巨噬細胞的信號通路主要與炎癥反應、免疫反應相關，例如PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路、NF-κB信號通路等。

PI3K/Akt信號通路上匯集多種胞內和胞外信號，可以調節巨噬細胞的遷移、增殖、自噬、極化、代謝功能和炎癥反應[23]。PI3K由調節亞基p85和催化亞基p110組成，能夠誘發其底物磷酸化為3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）。Akt是PI3K/Akt通路中調節巨噬細胞功能的最重要的效應分子，Akt2 能促使巨噬細胞向 M1 型極化[24]；敲除Akt2使miR-155水平降低，C/EBPβ（M2極化的調節因子）表達增加[25]。此外，Akt2缺陷的巨噬細胞能夠上調miR-164a導致TLR4信號通路的負調控，促進M2型極化[23]。研究表明，可以通過調節PI3K-p110蛋白表達，Akt磷酸化水平，調節巨噬細胞極化的作用，從而干預腫瘤微環境發揮抗腫瘤作用[26]。mTOR是PI3K/Akt的下游信號，在協調代謝和炎癥信號來調節巨噬細胞表型方面也發揮作用[27]。

HIF-1信號通路是生物處于低氧狀態下的應激信號通路，它由氧調節的α亞基和組成型表達的β亞基組成的異源二聚體。根據α亞基的不同，又分為 3種亞型，分別是 HIF-1α、HIF-2α和 HIF-3α，其中HIF-1α是介導缺氧信號的轉導中樞[28-29]。當PI3K/Akt信號通路的激活后，Akt磷酸化，能夠增強HIF-1α的活性，抑制其蛋白酶體降解[30]。HIF-α亞基可在巨噬細胞中被差異激活，Th1細胞因子能夠通過誘導HIF-1α調控巨噬細胞向M1型極化，相反，Th2細胞因子通過誘導HIF-2α調控M2型極化[31]，也有研究表明，通過作用于HIF-1α和HIF-1β的共有靶點IL-1β能夠影響巨噬細胞M1型極化和炎癥反應[32]。此外，HIF-1通路與細胞的代謝，尤其是糖酵解水平有關。LDHA、GLUT1、PDK1等均為HIF-1α的作用靶點。HIF-1α激活會增加巨噬細胞的遷移活性并影響巨噬細胞的代謝功能，巨噬細胞的代謝改變與其表型和功能密切相關[28，33]。研究表明，經泛素-蛋白酶體途徑促進HIF-1α蛋白降解，抑制糖酵解通路，能夠影響M1型巨噬細胞極化，抑制結腸炎發生[34]；抑制M2巨噬細胞線粒體氧化磷酸化，能夠抑制M2巨噬細胞極化，增強抗腫瘤效能[35]。

NF-κB信號通路是PI3K/Akt信號通路的下游通路之一，是調節炎癥因子產生的重要通路。IκB激酶被激活后，誘導NF-κB抑制蛋白磷酸化并降解，激活NF-κB，暴露出核定位序列，與細胞核內特定位點結合，啟動多種靶基因的轉錄，產生并釋放細胞因子[36]。脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞M1極化依賴于NF-kBp65的激活[37]。姚靜靜[38]提出通過NF-κB信號通路誘導M2巨噬細胞清道夫受體MSR1、CD36和內質網應激GRP78的表達，能夠影響巨噬細胞的極化。

本實驗基于M2巨噬細胞模型篩選的有效部位可能通過調控TAMs的免疫抑制活性在抗腫瘤治療中發揮作用。基于 LC-MS 結合網絡藥理學探討了20%甲醇洗脫部位調控巨噬細胞極化的物質基礎及分子機制，其分子機制可能是與PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路、NF-κB信號通路有關。本研究為后續深入驗證余甘子鞣質調控巨噬細胞的作用機制奠定基礎。