基于TLR4、NF-κB信號通路探討當歸拈痛湯治療痛風性關節炎的作用機制

劉毓，楊釗田，孫理軍（陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046）

痛風性關節炎（gouty arthritis，GA）是由于嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少致使尿酸鹽在關節囊、滑膜囊、軟骨、骨質等處沉積結晶而引起的慢性關節炎[1]，證屬中醫學“痹證”范疇，發作時關節紅腫熱痛，濕熱蘊結、阻滯關節等是其基本病機[2-4]。目前，GA急性發作期的主要治療方法包括抑制炎癥反應、促進尿酸排泄，但臨床效果不理想，不良反應明顯[5]。當歸拈痛湯具有清熱利濕、疏風止痛的效果，治療GA有較好的療效[6]。基于此，本研究利用網絡藥理學方法挖掘當歸拈痛湯改善GA的潛在作用靶點及信號通路，結合體內實驗驗證，探討當歸拈痛湯對GA的作用機制，為當歸拈痛湯用于臨床治療提供理論基礎和依據。

1 材料

1.1 試藥

當歸拈痛湯組成為羌活15 g，防風9 g，升麻3 g，葛根6 g，麩炒白術3 g，當歸9 g，黨參6 g，甘草15 g，苦參6 g，黃芩3 g，鹽知母9 g，茵陳15 g，豬苓9 g，鹽澤瀉9 g，蒼術9 g（陜西中醫藥大學第二附屬醫院）。雙氯芬酸鈉緩釋片（規格：75 mg/片，北京諾華制藥有限公司，批號：H10980297）。尿酸鈉鹽（MSU，美國Sigma公司，貨號：U2875-5G），HE染液（珠海BASO公司，貨號BA4025），Anti-NFκBp65（RELA）抗體（武漢boster公司，貨號A00284-1），抗兔/抗小鼠二抗（上海威奧公司，貨號WB0177/WB0176），IL-1β、IL-13 ELISA試劑盒（武漢boster公司，貨號分別為EK0393、EK0900），TNF-αELISA試劑盒（NOVUS公司，貨號VAL902）。

1.2 動物

SPF級雄性SD大鼠24只，體重（200±20）g [成都達碩實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（川）2020-030]，22～27℃飼養于陜西中醫藥大學中藥藥理實驗室動物房，動物自由飲水攝食。本研究中動物實驗經陜西中醫藥大學動物倫理委員會批準同意（批件號：SUCMDL20210305006）。

1.3 儀器

BX51顯微鏡（日本奧林巴斯），165-8001電泳儀、170-3930轉膜儀（美國Bio-Rad），TL-2010S組織勻漿器（北京鼎昊源公司），Fresco21臺式高速冷凍離心機、MutiskanTM GO全波長酶標儀（美國Thermo），TGL-16B高速臺式離心機（上海安亭公司），BS-220生化分析儀（深圳邁瑞公司）。

2 方法

2.1 網絡藥理學預測

2.1.1 當歸拈痛湯方有效成分及靶點的篩選 當歸拈痛湯由羌活、防風、升麻、葛根、白術、當歸、黨參、甘草、苦參、黃芩、知母、茵陳、豬苓、澤瀉、蒼術十五味藥組成，通過TCMSP（https：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數據庫獲得方中各中藥的化學成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18進行活性成分篩選。

2.1.2 GA的候選靶點的篩選 分別在OMIM（https：//www.omim.org/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）數據庫以“gouty arthritis”為檢索詞進行檢索，獲得GA的相關靶點基因。對兩數據庫檢索結果進行篩選合并去重，得到疾病相關靶點。

2.1.3 PPI蛋白相互作用網絡構建 將當歸拈痛湯與GA的共同靶點導入STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl）數據庫中，以人為目標物種，生成TSV文件。最終將其導入Cytoscape 3.6.1軟件中構建蛋白互作網絡（PPI）。

2.1.4 關鍵靶點GO分析及KEGG富集分析 為了探究當歸拈痛湯在治療GA過程中涉及到的生物學功能和途徑，本研究使用R語言對候選靶點進行GO富集分析和KEGG富集分析，P值小于0.05的GO術語或KEGG通路被認為是有顯著意義的。

2.2 實驗用藥制備

2.2.1 MSU溶液的制備 將1000 mg MSU，充分研磨后，加入36 mL 0.9%氯化鈉溶液，再加入4 mL吐溫-80（兩者體積比為 9∶1），再加入1 mL 1.5 mol·L-1NaOH，加熱攪拌，配制成25 mg·mL-1的MSU混懸液，4℃保存，用前搖勻。

2.2.2 雙氯芬酸鈉混懸液的制備 將200 mg雙氯芬酸鈉緩釋片溶于299 mL超純水中，制成質量濃度為0.67 mg·mL-1的雙氯芬酸鈉混懸液，密封。

2.2.3 當歸拈痛湯制備 稱取處方量中藥飲片，于煎藥煲中加入800 mL蒸餾水將各味藥物浸泡30 min。武火煮沸后轉文火煎煮40 min，將藥液倒出備用。往藥煲中加入600 mL蒸餾水進行二次煎煮，武火煮沸后文火煎煮30 min。將兩次煎煮所得藥液混合，紗布過濾后轉移至旋轉蒸發儀中濃縮至0.56 g·mL-1。冷卻后裝入滅菌50 mL離心管中-20℃保存備用。

2.3 實驗分組及造模

將24只雄性SPF級SD大鼠標準飼料適應性喂養1周后進行編號（1～24號），采用隨機數字表法分為空白對照組、模型對照組、雙氯芬酸鈉組、當歸拈痛湯中藥組，每組各6只。除空白對照組外，其余3組大鼠參照Coderre等[7]造模方法予大鼠右后側踝關節一次性注射25 mg·mL-1MSU溶液0.2 mL，建立急性GA模型，以關節囊對側鼓起為注入標準。空白對照組大鼠右后側踝關節注射0.2 mL生理鹽水。于造模后開始灌胃給藥，每日1次，灌藥周期參照臨床治療周期，共7 d。

驗證造模成功的標準：肉眼觀察造模后大鼠右踝關節明顯紅腫、行走緩慢。炎癥高峰時可見造模關節較健側關節紅腫明顯，皮溫升高，骨性標志消失，足爪卷曲、行走遲緩，嚴重者后肢過度俯曲跛行，甚則表現為三足步態，提示造模成功。

2.4 實驗給藥

雙氯芬酸鈉組按成人每日雙氯芬酸鈉緩釋片常用量150 mg，依據人與大鼠的體表面積轉換系數，按照成人體重70 kg換算得出每日藥物用量為13.39 mg·kg-1；大鼠當歸拈痛湯組藥量為每日11.25 g·kg-1；空白對照組與模型對照組予0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組灌胃量均為20 mL/（kg·d）（5 mL）。

2.5 實驗取材與檢測

2.5.1 一般情況 觀察大鼠精神、毛發、行動、飲食、排便、死亡等情況。

2.5.2 關節腫脹度測定 造模前，在大鼠右踝關節上方 0.5 mm 處用記號筆劃一條清晰的直線，用自制簡易足趾容積測量裝置分別于造模前（0 h）、造模后4、8、24、48、72 h測定大鼠關節容積（將10 mL針筒和2.5 mL 針筒相連接，將大鼠右后肢按照劃線放入10 mL針筒內，讀數，另一側2.5 mL針筒液面的前后差值即為足趾容積值）。

關節腫脹度＝造模后各時間點關節容積-造模前關節容積。

2.5.3 樣本采集 給藥結束后所有大鼠禁食12 h，不禁水，隨后處死取材，腹腔注射水合氯醛麻醉，麻醉劑量為9 mg·kg-1，腹主動脈取血，血液靜置1～2 h，離心15 min（4℃、3500 r·min-1，離心半徑15.7 cm），吸取上層血清，分裝，-20℃保存。以大鼠受試踝關節為中心，常規備皮、消毒，切取關節囊，分離滑膜組織，保存所需組織。

2.5.4 肝功能、腎功能、IL-1β、IL-13、TNF-α檢測 以全自動生化分析儀檢測大鼠肝功能[谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）]、腎功能[尿素（UREA）和肌酐（CREA）]水平。按試劑盒說明，常規方法測定大鼠血清中IL-1β、IL-13、TNF-α的濃度。

2.5.5 關節滑膜組織病理學觀察 取各組大鼠關節滑膜組織多聚甲醛固定24 h后脫水，依次進行脫水、石蠟包埋、切片，載玻片固定后脫蠟、乙醇梯度脫水、蒸餾水浸洗后蘇木素浸染3 min，伊紅浸染1 s，脫水烘干后中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察。

2.5.6 關節滑膜組織TLR4、NF-κB-p65蛋白表達檢測 提取關節滑膜組織總蛋白，BCA法測定組織蛋白濃度，將所有樣本蛋白調整至同一濃度后，100℃使蛋白變性，5 min后放置于冰上冷卻，離心取上清液。以每孔10 μL上樣，進行電泳，待指示劑到達距凝膠下端約0.5 cm處時取出膠板，并在低溫條件下轉膜，轉膜結束立即取出PVDF膜，放置于5%BSA室溫封閉，2 h后，用1×TBST洗膜3次，5 次·min-1。加入抗體TLR4（1∶1000）、NF-κB（1∶1000）、β-actin（1∶2000），4℃孵育過夜，1×TBST清洗3次，5 次·min-1。加入HRP標記的山羊抗鼠二抗（1∶2000），室溫孵育2 h，1×TBST清洗5次，15 次·min-1。配制化學發光檢測試劑（試劑A∶試劑B＝1∶1）并與膜孵育2 min，曝光顯影。以β-actin蛋白表達量進行校正，借助Image J軟件分析各蛋白灰度值。

2.6 統計分析

采用 SPSS 26.0軟件進行統計分析，計量資料呈正態分布，用平均數±標準差（±s）表示，多組數據比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較，若方差齊，采用LSD 法；方差不齊，采用Tamhane’s T2 法。偏態分布資料以中位數（四分位數間距）[M（Q25，Q75）]表示，采用非參數檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 網絡藥理學研究

3.1.1 當歸拈痛湯活性成分及候選靶點的篩選從TCMSP數據庫中篩選出來自15種中藥的315個活性成分。檢索結果表明羌活中活性成分15個，防風中18個、升麻中17個、葛根中4個、白術中7個、當歸中2個、黨參中21個、甘草中92個、苦參中45個、黃芩中36個、知母中15個、茵陳中13個、豬苓中11個、澤瀉中10個、蒼術中9個。通過TCMSP數據庫檢索并刪除重復靶點后，共獲得253種活性成分的潛在作用靶點。同時，從GeneCards及OMIM數據庫中共獲得疾病靶點1762個，并將活性成分潛在作用靶點和GA相關靶點均轉換成標準基因名。Venn交集處理之后獲得兩者的共同靶點110個，這些靶點被認為是當歸拈痛湯治療GA的候選靶點。“中藥-活性成分-靶點”網絡中含有311個節點和1194條邊。在該網絡中，從活性成分角度來看，甘草異黃酮（licoisoflavone，63343-94-2）、漢黃芩素（wogonin，632-85-9）、磷脂查爾酮（glypallichalcone，146763-58-8）、鱗葉甘草素A（glepidotin A，42193-83-9）、粗毛甘草素C（glyasperin C，142474-53-1）等可能是當歸拈痛湯治療GA的關鍵活性成分。

3.1.2 當歸拈痛湯治療GA的PPI網絡分析為了探究共同靶點之間的互作關系，將其導入STRING數據分析平臺，以人為目標物種，生成TSV文件。用Cytoscape 3.6.1軟件構建PPI，如圖1所示共得到108個有效節點，1867條邊，節點越大表明靶點degree值（度值）越高，在PPI網絡中，度值較高的蛋白在中心關聯中起著重要的作用。以度值大小作為評價指標，獲得排名前20的候選靶點，分別是VEGFA、STAT3、PTGS2、PPARG、VCAM1、RELA、MMP9、MYC、NFKBIA、STAT1、SERPINE1、PPARA、MMP2、MTOR、IL-6、NOS3、SELE、JUN、SPP1、MAPK3。

圖1 當歸拈痛湯治療GA的蛋白互作網絡Fig 1 Protein interaction network of Danggui Niantong decoction for gouty arthritis

3.1.3 高頻藥物的GO分析和KEGG分析 通過使用R4.1.1數據包對所篩選出的基因列表進行GO富集分析功能，選取P＜0.01的20條通路得到氣泡圖，見圖2。分子功能中排名前3的分別是DNA結合轉錄因子結合、磷酸酶結合和RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合。生物過程排名前3的分別是對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應和對營養水平的反應。細胞成分排名前3的是膜筏、膜微區和囊泡腔。

圖2 當歸拈痛湯治療GA的GO富集分析Fig 2 GO enrichment analysis of Danggui Niantong decoction in GA treatment

通過KEGG通路富集篩選得到175條信號通路，故選取P＜0.01的30條通路，見圖3。經過KEGG通路富集篩選，選取與GA相關的通路，發現疾病相關基因在NF-κB信號通路（NF-κB signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）及TNF信號通路（TNF signalingpathway）上富集的較多。

圖3 當歸拈痛湯作用靶點的KEGG富集分析Fig 3 KEGG enrichment analysis of the target of Danggui Niantong decoction

3.2 動物實驗驗證

3.2.1 一般情況 造模前各組大鼠精神良好，反應迅捷，毛發有光澤，飲食排便正常。造模后，除空白對照組外，其余各組大鼠均出現不同程度的右踝關節紅腫、足爪卷曲、行走遲緩、跛行，甚至表現為三足步態。模型對照組與給藥組大鼠均出現活動量及飲食量減少，體重減輕。模型對照組大鼠出現精神倦怠，反應遲鈍，毛發枯槁，大便稀溏；給藥組大鼠精神欠佳，皮毛欠光澤，好于模型對照組。實驗期間未出現大鼠死亡。

3.2.2 當歸拈痛湯對GA大鼠型空關節腫脹度的影響 造模后4 h，模型對照組踝關節腫脹度較空白對照組顯著升高（P＜0.01）；造模后8 h，模型對照組較空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01），各給藥組關節腫脹度均有降低，雙氯芬酸鈉組較模型對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；造模后模型對照組較空白對照組差異有統計學意義（P＜0.01），給藥組關節腫脹度持續降低，造模后48、72 h與模型對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05），見表1。

表1 當歸拈痛湯對GA大鼠踝關節腫脹度的影響(±s，n＝6，mL)Tab 1 Effect of Danggui Niantong decoction on ankle swelling in GA rats (±s，n＝6，mL)

表1 當歸拈痛湯對GA大鼠踝關節腫脹度的影響(±s，n＝6，mL)Tab 1 Effect of Danggui Niantong decoction on ankle swelling in GA rats (±s，n＝6，mL)

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank control group，##P＜0.01；compared with the model control group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別劑量/（g·kg-1）造模后時間4 h8 h24 h48 h72 h空白對照組0.16±0.040.14±0.040.08±0.050.05±0.050.03±0.04模型對照組0.66±0.10##0.64±0.10##0.57±0.10##0.50±0.09##0.41±0.04##雙氯芬酸鈉組0.000 670.63±0.070.47±0.09*0.36±0.07**0.28±0.05**0.14±0.04**當歸拈痛湯組0.560.67±0.130.50±0.140.46±0.130.38±0.10*0.21±0.05**

3.2.3 當歸拈痛湯對GA大鼠血清炎癥因子水平的影響 血清炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-13在模型對照組中較空白對照組均顯著升高（P＜0.01），IL-1β、TNF-α各給藥組中均有降低，與模型對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。IL-13給藥組較模型差異無統計學意義。具體見表2。

表2 當歸拈痛湯對GA大鼠血清IL-1β、IL-13、TNF-α的影響(±s，n＝6)Tab 2 Effect of Danggui Niantong decoction on the serum IL-1β，IL-13 and TNF-α in GA rats (±s，n＝6)

表2 當歸拈痛湯對GA大鼠血清IL-1β、IL-13、TNF-α的影響(±s，n＝6)Tab 2 Effect of Danggui Niantong decoction on the serum IL-1β，IL-13 and TNF-α in GA rats (±s，n＝6)

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank control group，##P＜0.01；compared with the model control group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別劑量/（g·kg-1）IL-1β/（pg·mL-1）IL-13/（pg·mL-1）TNF-α/（pg·mL-1）空白對照組24.32±1.39 8.17±0.4368.44±3.10模型對照組31.82±2.10##17.99±1.08##83.21±3.20##雙氯芬酸鈉組0.000 6725.51±0.82**16.38±1.2367.95±0.89**當歸拈痛湯組0.5626.80±1.28**16.34±1.0479.24±1.83*

3.2.4 當歸拈痛湯對GA大鼠肝腎功能的影響如表3所示，與空白對照組相比，模型對照組ALT、AST差異無統計學意義；除雙氯芬酸鈉組ALT較模型對照組下降外，其余各給藥組ALT、AST水平與模型對照組相比差異均無統計學意義。提示各組藥物未對大鼠肝功能造成不良損害。

表3 當歸拈痛湯對GA大鼠ALT、AST的影響(±s，n＝6)Tab 3 Effect of Danggui Niantong decoction on ALT and AST in GA rats (±s，n＝6)

表3 當歸拈痛湯對GA大鼠ALT、AST的影響(±s，n＝6)Tab 3 Effect of Danggui Niantong decoction on ALT and AST in GA rats (±s，n＝6)

注：與模型對照組比較，*P＜0.05。Note：Compared with the model control group，*P＜0.05.

組別劑量/（g·kg-1）ALT/（U·L-1）AST/（U·L-1）空白對照組33.24±1.51137.87±27.18模型對照組34.59±2.40138.33±31.57雙氯芬酸鈉組0.000 6726.50±4.33*158.02±45.26當歸拈痛湯組0.5633.82±4.36103.05±10.60

如表4所示，與空白對照組相比，模型對照組UREA、CREA差異無統計學意義；除雙氯芬酸鈉組UREA較模型對照組有所下降（P＜0.05），其余各組UREA、CREA與模型對照組相比差異均無統計學意義。提示各組藥物未對大鼠腎功能造成不良損害。

表4 當歸拈痛湯對GA大鼠UREA、CREA的影響(±s，n＝6)Tab 4 Effect of Danggui Niantong decoction on UREA and CREA of GA rats (±s，n＝6)

表4 當歸拈痛湯對GA大鼠UREA、CREA的影響(±s，n＝6)Tab 4 Effect of Danggui Niantong decoction on UREA and CREA of GA rats (±s，n＝6)

注：與模型對照組比較，*P＜0.05。Note：Compared with the model control group，*P＜0.05.

CREA/（μmol·L-1）空白對照組6.19±1.0943.61±5.61模型對照組7.03±1.3043.78±6.64雙氯芬酸鈉組0.000 674.28±0.88*41.01±4.54當歸拈痛湯組0.564.95±0.641.08±4.93組別劑量/（g·kg-1）UREA/（mmol·L-1）

3.2.5 當歸拈痛湯對GA大鼠踝關節組織病理學的影響 根據大鼠踝關節HE染色結果可知，空白對照組大鼠踝關節滑膜組織的細胞結構完整，層次清晰，無腫脹增生，未見或僅見極少量炎性細胞浸潤；模型對照組滑膜細胞增生，局部可見細胞變性壞死，大量炎性細胞浸潤。雙氯芬酸鈉組相比于模型對照組，炎性細胞明顯減少，部分滑膜細胞增生，當歸拈痛湯組見少量炎性細胞浸潤，局部有滑膜輕度增生。見圖4。

3.2.6 當歸拈痛湯對GA大鼠踝關節滑膜組織中TLR4、NF-κB-p65蛋白表達的影響 由圖5～6可知，TLR4蛋白在模型對照組中表達較空白對照組升高（P＜0.01），雙氯芬酸鈉組、當歸拈痛湯組表達較模型對照組降低（P＜0.05，P＜0.01）。NF-κB-p65蛋白在模型對照組中表達較空白對照組升高（P＜0.01），雙氯芬酸鈉組與當歸拈痛湯組表達較模型對照組降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 各組TLR4、NF-κB-p65蛋白表達電泳Fig 5 Electrophoresis of TLR4，NF-κB-p65 protein expression in each group

圖6 當歸拈痛湯對 GA 大鼠 TLR4/β-actin、NF-κB-P65/β-actin 的影響Fig 6 Effect of Danggui Tiantong decoction on TLR4/β-actin and NFκB-P65/β-actin in GA rats

4 討論

當歸拈痛湯出自《醫學啟源》，是清熱利濕、疏風止痛之名方，方中君藥羌活透利關節、防風祛風勝濕止痛；臣藥升麻、葛根引陰中之陽上行以解表疏風，白術、蒼術燥濕健脾以化濕；方中所用除濕藥性偏苦燥，易傷氣血津液，故以黨參、當歸益氣養血，并取當歸活血散瘀止痛之效，苦參、黃芩、知母、茵陳泄濕熱、除煩痛，且知母能防苦燥之藥傷陰，祛邪不傷正；豬苓、澤瀉淡滲利濕，導其留飲，共為佐藥；使藥（炙）甘草調和諸藥。大量實驗與臨床研究證明了當歸拈痛湯治療GA的有效性，其能夠改善骨損傷和滑膜纖維化、抑制滑膜增生、炎性細胞浸潤[8-18]。痛風和高尿酸血癥病證結合診療指南也指出當歸拈痛湯治療GA的作用已被認可[19]。雙氯芬酸鈉在臨床上使用較為廣泛，是治療GA的首選非甾體類藥物，故本實驗選用雙氯芬酸鈉作為陽性對照藥物。此次實驗中模型大鼠踝關節出現紅腫熱痛等急性炎癥表現，病理組織切片顯示的炎性細胞浸潤、關節腔贅生物和滑膜增生等，宏觀角度證明了當歸拈痛湯能減輕大鼠關節腫脹與疼痛，減輕炎性浸潤與滑膜增生，初步驗證了當歸拈痛湯的有效性。

既往對當歸拈痛湯治療GA抗炎有效性的研究很多，但對其機制方面的研究較少。為深入研究當歸拈痛湯治療GA的作用機制，本文采用網絡藥理學方法篩選出當歸拈痛湯治療GA的315個活性成分、30條通路和110個靶點。基于網絡藥理學獲取的多種活性成分，甘草異黃酮、漢黃芩素、磷脂查爾酮、鱗葉甘草素A、粗毛甘草素C等對應靶點較多，可能是治療GA的主要活性成分。甘草異黃酮為甘草黃酮中的其中一類，其中以異甘草素為代表。異甘草素能抑制巨噬細胞的極化，下調前列腺素和IL-6的表達[20-21]。痛風患者體內高水平的尿酸鈉和炎癥因子能夠刺激巨噬細胞表面的CD14、TLR4，在細胞內激活IL-1受體相關激酶2（IRAK2），進而上調NF-κB信號，促進巨噬細胞向M1型極化，引起IL-1β、IL-6等促炎因子分泌，且M1型巨噬細胞的過度積聚會加劇炎癥反應[22-27]。異甘草素還能抑制TLR4的二聚化，阻滯炎性信號傳導而減少炎性因子和炎癥介質的合成釋放[28]。更有研究發現，異甘草素通過阻止NF-κB抑制因子（IκB）的磷酸化和降解，抑制了TNF-α誘導的中性粒細胞對內皮細胞層的黏附和NF-κB的激活，從而抑制炎癥反應。管燕等[29]也從基因與蛋白水平證明了甘草黃酮可降低TNF-αmRNA和IL-1βmRNA的轉錄水平并抑制TNF-α的蛋白表達，有明顯的抗炎活性；并且驗證了甘草查爾酮A對NF-κB活性的抑制作用。漢黃芩素在獲取的活性成分中位列第二，其不僅能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，發揮抗炎作用[30-32]，還能抑制炎性因子、黏附分子、趨化因子等聚集于關節滑膜處[33]。有學者認為其機制可能是漢黃芩素在結晶表面形成保護膜從而減少結晶黏附[34]。

基于GO富集與KEGG富集分析篩選出3條重要通路：Toll樣受體、NF-κB及TNF信號通路。Toll樣受體（TLR）是膜結合受體，在先天免疫細胞（如巨噬細胞和樹突狀細胞）上表達，TLRs通過誘導促炎細胞因子的產生和共刺激分子的上調來引起先天免疫的快速激活。TLR最常見的為可溶性的TLR4，大量研究表明TLR4/NF-κB信號傳導通路在GA的炎癥反應中起著重要作用[35]。MSU結晶能直接激活TLR4，其通過MyD88依賴途徑可與MyD88相互作用，使活化的MyD88募集下游絲/蘇氨酸蛋白激酶IRAKⅠ和IRAKⅡ，隨后IRAK4將IRAKI磷酸化并使之分離，分離出的IRAKⅠ與TNF受體相關蛋白6（TRAF6）結合，激活轉化生長因子激活性激酶1（TAK1），磷酸化了B細胞k輕肽基因增強子抑制劑（IKK）復合體，從而釋放NF-κB，調控下游炎癥因子IL-1、lL-6、TNF-α等的釋放，介導痛風炎癥反應[36]。

TNF也是介導炎癥的重要通路，其能誘導巨噬細胞向M1型極化，分泌促炎因子[37]。活化的TNF與其主要受體結合，介導下游NF-κB信號通路的信號傳導，以促進炎癥反應。此次研究結果顯示，TLR4、NF-κB-p65蛋白在模型對照組中表達較空白對照組升高，當歸拈痛湯干預后兩者表達較模型對照組降低，證明當歸拈痛湯能夠有效抑制TLR4、NF-κB的信號傳導，抑制炎癥反應。

基于PPI，篩選并分析發現Rel A（P65）和PTGS2是兩個較為重要的靶點。Rel A（P65）亞基是NF-κB家族5個成員之一，NF-κB是其亞基的同源/異源二聚體，NF-κB作為二聚體調節與免疫、炎癥相關的基因。NF-κB可由TNF-α、IL-1誘導激活，其依賴于IKK介導的Ser32和36上的NF-kB抑制劑（IκBα）磷酸化和降解的途徑，使p50/p65 NF-κB二聚體進入細胞核并激活基因轉錄，這在炎癥反應和細胞凋亡過程中起重要作用。PTGS2即前列素內環氧化物合成酶2（COX-2），是炎癥反應的另一重要因素。研究顯示，在炎性環境下，關節中的滑膜組織會產生前列腺素，增加COX-2活性，而引起關節疼痛[38]。雙氯芬酸鈉能抑制環氧化酶活性，從而阻斷前列腺素的生成以治療GA[39]。通過網絡藥理學預測分析，當歸拈痛湯可能也存在與雙氯芬酸鈉相似的作用機制。

研究顯示GA患者會出現血清IL-1β、TNF-α等炎癥因子含量升高，滑膜組織不連續，炎性細胞浸潤及關節腔贅生物等表現[40-42]。關節炎發作期間，大量中性粒細胞向關節浸潤聚集并受MSU晶體激活，隨之活化的中性粒細胞與MSU晶體接觸產生和釋放活化的IL-1β，形成網狀沉淀[43-44]；同時也會釋放TNF-α、IL-6等進一步激活局部炎癥，加劇疼痛[45-47]。在炎性滑膜組織中，MSU向關節軟骨表面遷移，侵蝕關節軟骨，破壞關節組織。IL-13在GA治療過程中表現出較強的抗炎活性，能有效下調IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子生成[48-51]。但IL-13與IL-4、IL-10等抗炎因子不同，其在GA急性期表現為低水平，在GA緩解期則處于高水平[52]。本研究采集大鼠樣本時已過GA急性發作期，模型對照組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-13顯著升高，與GA炎癥反應特點一致。證明通過當歸拈痛湯的干預，明顯減少了GA模型大鼠體內及組織中炎性介質的釋放。

有學者對當歸拈痛湯干預后的GA模型進行了體重的組間和組內比較，均未發現顯著差異，提示當歸拈痛湯對體重無明顯影響，安全、可行[53]，網絡藥理學方法篩選出的重要化學成分，甘草異黃酮與漢黃芩素均有護肝的功效[54-56]，本實驗結果也證實了當歸拈痛湯對GA大鼠模型沒有造成肝損傷。

根據網絡藥理學中通路、靶點以及活性成分的篩選結果，本實驗認為當歸拈痛湯通過調控TLR4、NF-κB、TNF-α等相關通路，增加抑炎因子IL-13水平，減少TNF-α、IL-1β等炎性因子釋放，從而干預GA，且甘草異黃酮、漢黃芩素可能為發揮抗炎作用的關鍵成分。本研究證明了當歸拈痛湯能通過多靶點、多途徑實現抗痛風作用，并結合動物實驗初步驗證了當歸拈痛湯干預GA的效果。然而當歸拈痛湯中藥成分較多且有效物質基礎復雜，因此在未來研究中，本課題將繼續完善當歸拈痛湯的有效成分研究，進一步明確其治療GA的物質基礎。此外，本實驗僅從蛋白水平闡明了當歸拈痛湯的作用效果，其基因水平是否發生變化還有待驗證。