基于UPLC-Q-TOF HRMS技術建立逍遙丸指紋圖譜及化學成分鑒定

王雅靜，周思倩，，馮敏，潘呂婷，趙洪慶，吳娟，，邵樂，龍紅萍*（.湖南中醫藥大學，長沙 4008；.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 40007）

逍遙丸出自《太平惠民和劑局方》，由柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓等8味中藥組成，有疏肝健脾、養血調經之功效，常用于治療神經疾病、免疫疾病和婦科疾病，是主治“肝郁脾虛”證候的經典名方[1-3]。目前，對于逍遙丸的研究主要集中在對抑郁、婦科疾病、免疫疾病等患者臨床療效的探討以及作用機制的研究[4-5]，而關于其質量控制方面的文獻報道較少，且逍遙丸在《中國藥典》2020年版中僅以芍藥苷作為指標性成分，其質量標準中指控成分單一，缺乏能表征其化學輪廓特征的指紋圖譜相關研究，不足以全面反映逍遙丸制劑的整體質量。中藥指紋圖譜將中藥與中藥制劑主要成分、組成特征進行系統展示，是中藥質量控制的重要手段，已廣泛應用于中藥多組分復雜體系的質量評價研究[6-9]。基于此，本研究通過建立逍遙丸的指紋圖譜，同時應用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間高分辨質譜（UPLC-Q-TOFHRMS）對逍遙丸指紋圖譜中共有峰的化學成分進行全面表征，以期為其質量控制和評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290UPLC-6540 Q-TOF色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫Agilent科技公司，配置MassHunter質譜工作站和Mass analysis質譜數據處理系統），超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司），S-23高速臺式離心機（湖南湘儀儀器有限公司），AUW120D電子分析天平（日本SHIMADZU公司）。

1.2 試藥

對照品腺苷（上海同田生物技術有限公司，批號：3080-29-3），芍藥苷（批號：107D021）、芍藥內酯苷（批號：20200419）、阿魏酸（批號：1135-24-6）、白術內酯Ⅰ（批號：73069-13-3）、Z-藁本內酯（批號：903C021）（北京索萊寶科技有限公司）；柴胡皂苷a（批號：A20736-09-8）、綠原酸（批號：327-97-9）、甘草苷（批號：551-15-5）（中國食品藥品檢定研究院），苯甲酰芍藥苷（北京亞希爾科技有限公司，批號：38642-49-8）、白術內酯Ⅱ（上海源葉生物科技有限公司，批號：73069-14-4），所有對照品質量分數均大于98.0%。

逍遙丸（仲景宛西制藥股份有限公司，批號為200423、200511、200530、200714、201031、201104、210308、210322、210415、210529、210722、210914，分別編號為S1～S12）；色譜甲醇、質譜乙腈（德國Merck Millipore公司）；蒸餾水（深圳屈臣氏蒸餾水有限公司）；甲酸（質譜級，美國Fisher公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流動相由乙腈（A）和水（含0.05 mmol·L-1甲酸）（B），梯度洗脫：0～10 min，5%～15%A；10～20 min，15%～35%A；20～30 min，35%～55%A；30～40 min，35%～85%A；40～50 min，85%～95%A）；流速：0.4 mL·min-1，進樣量：2 μL。

2.2 質譜條件

采用正離子分析模式，離子化方式為電噴霧離子化（ESI），進樣分析前采用安捷倫標準調諧液ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-85000）進行準確質量數的校正。一級質譜掃描檢測范圍：m/z100～1700，采用氮氣為干燥氣體，溫度為325℃，流速為6.8 L·min-1；鞘氣溫度為350℃；毛細管電壓為4.0 kV，Fragment電壓為30、20、10 eV。

2.3 逍遙丸溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 精密稱取12批逍遙丸粉末各3.0 g，置于50 mL的具塞錐形瓶中，精密加入30 mL的甲醇溶液，稱重，超聲處理30 min，放冷，加甲醇補足失重，8000 r·min-1離心5 min，吸取樣品上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得逍遙丸供試品溶液。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品腺苷、芍藥苷、芍藥內酯苷、綠原酸、阿魏酸、甘草苷、Z-藁本內酯、苯甲酰芍藥苷、柴胡皂苷a、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ 11個對照品各10 mg，置于25 mL量瓶中，加入甲醇25 mL，超聲溶解，靜置后定容至刻度，即得質量濃度為0.4 mg·mL-1對照品溶液儲備液。分別從各量瓶中取50 μL對照品溶液混勻，即得混合對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（S1），連續進樣6 次，記錄色譜圖。選擇 6號峰（芍藥內酯苷）為參照峰，計算12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差（RSD），結果分別為RSD＜0.2%和RSD＜4.5%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取S1號樣品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄色譜圖。選擇6號峰（芍藥內酯苷）保留時間和相對峰面積為參考，12個共有峰相對保留時間的RSD＜1.2%和相對峰面積的RSD＜4.7%，表明供試品溶液在 24 h內穩定。

2.4.3 重復性試驗 取樣品S1粉末適量，精密稱定3份，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。以6號峰（芍藥內酯苷）保留時間和相對峰面積為參考，計算12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，分別為0.02%～0.68%和2.6%～5.0%，表明該方法的重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 共有峰標記 按“2.3.1”項下方法制備的12批逍遙丸供試品溶液（樣品 S1～S12），進樣測定，將數據導入2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統” 軟件進行分析，對照圖譜采用“中位數”法生成，使用多點校正對色譜峰進行匹配。12批逍遙丸供試品溶液的指紋圖譜見圖1，11個混合對照品溶液色譜圖見圖2。

圖1 12批逍遙丸的指紋圖譜（S1～S12）及其對照圖譜（R）Fig 1 Fingerprint map（S1～S12）and reference map（R）of Xiaoyao pills

圖2 11個對照品總離子流圖Fig 2 Total ion flow diagram of 11 reference substance

2.5.2 相似度評價及共有峰歸屬 選擇樣品S1的譜圖作為參照譜圖，時間窗寬度設為0.1 min，選取多個特征峰進行多點校正，自動峰匹配，共標定35個共有峰。對12批逍遙丸供試品溶液色譜圖和對照譜圖進行相似度評價，S1～S12 相似度均大于0.982，表明12批次逍遙丸樣品制備工藝較為穩定，結果見表1。對逍遙丸指紋圖譜中的35個特征峰進行歸屬，并與混合對照品溶液比對，確定了其中11個成分，其中2（腺苷）、25（柴胡皂苷a）號峰來源于柴胡；5（綠原酸）、8（阿魏酸）、32（Z-藁本內酯）號峰來源于當歸；6（芍藥內酯苷）、7（芍藥內酯苷）、18（苯甲酰芍藥苷）號峰來源于白芍；12（甘草苷）號峰來源于甘草；31（白術內酯Ⅱ）、33（白術內酯Ⅰ）號峰來源于白術。

表1 12批樣品峰及其對照峰的相似度表Tab 1 Similarity of 12 batches sample peaks and their reference peaks

2.6 UPLC-Q-TOF HRMS對共有峰化學成分定性分析

通過使用Agilent TCM-DATA中藥成分數據庫生成分子式、依照誤差小于5×10-6的原則進行篩選，同時檢索中國知網（CNKI），PubMed、Massbank等數據庫，建立逍遙丸藥材的化學成分信息庫。根據化合物的精確相對分子質量、保留時間及二級質譜信息，以及比對自建中藥成分化合物庫，并結合文獻數據在逍遙丸溶液中共確定35個化學成分，其中包括萜類9個、黃酮類7個、皂苷類5個、苯丙素類3個、苯酞類2個、核苷類1個、酚類1個、其他類化合物7個，結果見表2。

3 討論

3.1 色譜條件的考察

在指紋圖譜的研究中，色譜條件考察了乙腈-甲酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸水溶液等流動相系統，結果流動相為乙腈-甲酸水溶液的梯度洗脫基線平穩，色譜峰分離效果最佳。在色譜柱考察中，分別對比了3個不同生產廠家的色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、Waters BEH C18和Diamonsil C18，發現Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱分離效果最好。另外，檢測波長考察了254 nm和300 nm，結果在254 nm波長處各成分色譜峰分離較好，且基線峰平穩，故選擇其作為檢測波長。

3.2 逍遙丸指紋圖譜共有峰的鑒定

在UPLC-Q-TOF HRMS定性分析研究中，對于質譜條件進行了優化，由于中成藥中成分較為復雜，課題組前期采用正、負離子模式對逍遙丸的化學成分進行系統分析，發現逍遙丸中的化學成分在正離子模式下質譜有響應且信號較好，因此，本文的指紋圖譜和化合物鑒定均采用正離子模式。本研究采用UPLC-Q-TOF HRMS技術共鑒定出逍遙丸指紋圖譜中35個化學成分，柴胡中以皂苷類成分為主，當歸中的成分以單萜類和苯丙素類為主，甘草中的成分多為黃酮類化合物，白術中的成分以倍半萜類為主，白芍中以單萜類為主。現代研究表明逍遙丸中的君藥柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d能顯著下調白細胞介素表達水平，減輕HPA軸功能障礙的作用[19]；臣藥白芍中的芍藥苷和芍藥內酯苷能調節神經遞質釋放、可顯著抑制腦內單胺氧化酶的活性，當歸中的Z-藁本內酯發揮神經保護作用，同時對單胺氧化酶具有一定的抑制作用[20]，白術、茯苓、甘草、薄荷佐藥中薄荷酮能抑制HPA 軸過度活化，甘草苷、異甘草苷、茯苓多糖能調節單胺類神經遞質[21]。中藥復方發揮藥效作用是多個成分共同起效的結果，本研究通過采用UPLC-Q-TOF HRMS技術，對其指紋圖譜共有峰進行精準指認，為后續逍遙丸指標成分的選擇提供參考依據。

本研究建立了12批逍遙丸指紋圖譜，發現了35個共有峰，同時結合UPLC-Q-TOF HRMS技術快速、準確地分析其化學成分，進一步闡明了逍遙丸的藥效物質基礎，為建立逍遙丸質量標準提供方法和參考依據。