NAD（H）調控線粒體功能在疾病中的作用

程子捷，呼慶勛（上海大學醫學院，上海 200444）

線粒體是細胞內的重要細胞器，對維持細胞結構與功能具有多重作用。作為細胞的能量供應車間，線粒體利用多種能量物質合成生命活動所需的三磷酸腺苷（ATP）；作為生物合成中心，核酸等生物大分子的合成前體在線粒體內生成；此外，線粒體內存在多種酶參與細胞信號傳導和細胞凋亡等過程，并在調控細胞生長和細胞周期中發揮重要作用[1]。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD（H）是一種存在于活細胞中的輔酶，在生物體內常以氧化態NAD+和還原態NADH的形式存在；在細胞內的一系列生物過程中，兩者可以相互轉化。研究表明，NAD（H）不僅是線粒體中必不可少的氧化還原輔助因子，也作為關鍵信號分子，在發生營養攝入改變或細胞損傷等環境變化時調控細胞功能，包括影響線粒體功能、DNA 損傷修復、細胞凋亡、細胞衰老、信號轉導等多個方面[2-3]。越來越多的證據表明，細胞內NAD（H）代謝異常會影響線粒體結構與功能，從而誘發多種疾病。本文綜述NAD（H）在細胞內的合成、消耗、轉化與檢測過程，并闡述NAD（H）通過調控線粒體功能影響疾病發生與發展的分子機制，旨在為疾病預防和診療提供新的研究思路。

1 NAD（H）的合成與轉化

1.1 NAD（H）的合成

NAD（H）幾乎存在于生物體內所有活細胞中，主要有三種合成路徑，分別為犬尿酸途徑（De Novo synthesis）、Preiss-Handler途徑和補救途徑（Repair）（見圖1）。

圖1 NAD（H）的生物合成途徑Fig 1 Biosynthetic pathway of NAD（H）

在犬尿酸途徑中，色氨酸（Trp）經多步反應轉化為煙酸單核苷酸（NAMN），NAMN最終經一系列酶的催化生成NAD（H）[3-5]。

在Preiss-Handler途徑生成中，煙酸（NA）經煙酸轉磷酸核糖基酶（NAPRT）催化作用生成NAMN。NAMN最終經一系列酶的催化生成NAD（H）[3-5]。

在哺乳動物中，第三種NAD（H）合成路徑——通過“補救途徑”從煙酰胺（NAM）、NA、煙酰胺核苷（NR）和煙酰胺單核苷酸（NMN）中回收是維持胞內NAD（H）正常水平最重要的合成途徑[3]。NAM既是NAD（H）消耗酶如NAD（H）依賴的蛋白去乙?；竤irtuins（SIRTs）、聚ADP-核糖聚合酶（PARPs）、CD38等的副產物，也可能來源于外界食物攝取[4]。在補救途徑中，首先NAM經煙酰胺轉磷酸核糖基酶（NAMPT）和煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶（NMNAT）催化生成NAD（H）[6]。其中NMNAT3主要分布在線粒體中，對線粒體呼吸產生重要影響[7-8]。

1.2 NAD（H）的消耗

在生物體中，NAD（H）合成與降解之間存在動態平衡。與氧化還原反應不同，在細胞內存在多種酶，包括SIRTs、PARPs、NAD（H）糖水解酶與環ADP-核糖（cADPR）合成酶CD38、CD157和SARM1（sterile alpha and TIR motif containing 1）等，能夠在發揮自身生理功能的同時，將NAD（H）分解為NAM[9]。

目前已發現SIRTs家族中存在七種亞型，分別命名為SIRT1～SIRT7，其中SIRT3～SIRT5主要分布在線粒體；作為NAD（H）依賴的蛋白去乙酰化酶，SIRTs與特定蛋白相結合并發生去乙?；⑤o助底物NAD（H）轉化為NAM，從而調節生物體內關鍵信號通路[10-12]。PARP1-PARP3能夠將NAD（H）作為單ADPR或聚ADPR靶蛋白的共底物，介導NAD（H）分解產生副產物NAM和ADPR，并在DNA損傷修復、轉錄調控、細胞凋亡等過程中發揮作用[9，13]。

CD38和CD157是多功能的胞外酶，具有糖水解酶和ADP-核糖環化酶的活性，將NAD（H）分解為NAM和cADPR[14-15]；此外，二聚化SARM1能夠產生相似催化作用，將NAD（H）水解為ADPR和NAM，并產生少量的cADPR[16]。

1.3 NAD（H）的生物轉化

1.3.1 NAD+與NADH的相互轉化 葡萄糖是人體內的主要能量來源，進入胞質后在多種酶的催化下經有氧糖酵解生成丙酮酸，在此過程中伴隨著NAD+和NADH的轉化及ATP生成[17]。此后，丙酮酸在胞質內生成乳酸，或進入線粒體后經氧化脫羧生成乙酰輔酶A，從而參與三羧酸循環（TCA循環）；在此過程中生成大量ATP，同時NAD+轉化為NADH[18]。最終，NADH經電子傳遞鏈（ETC）再次氧化為NAD+，維持細胞內NADH與NAD+的動態平衡；隨著質子從線粒體內膜向外層轉移，所形成的跨膜氫離子梯度提供勢能，驅動氧化磷酸化（OXPHOS）反應合成ATP，這一過程由五種結構復雜的酶協同催化完成[9，18]（見圖2）。

圖2 NAD（H）的生物轉化途徑Fig 2 Biological conversion of NAD（H）

有研究表明，約有70%的NAD（H）存在于線粒體中；脂質載體蛋白（SLCs）是生物體內重要的轉運家族，其中SLC25A51通過調控線粒體代謝和ETC中復合物Ⅰ的功能，進而影響線粒體消耗氧氣和產生ATP以及將NAD+轉運到線粒體基質中的能力[19]。由于細胞內的大多數生理活動都依賴ATP提供能量，因此探究NAD（H）對線粒體能量代謝和器官功能的影響具有重要意義。

1.3.2 NAD+與NADP+的相互轉化 除了NAD+與NADH的相互轉化，細胞內約有10%的NAD+可以被煙酰胺核苷酸轉氫酶（NNT）和NAD+激酶（NADKs）磷酸化為NADP+[3]。NADPH是NADP+的還原形式，線粒體內NADPH可在ME3將丙酮酸轉化為蘋果酸的過程中和IDH2催化異檸檬酸轉化為α-酮戊二酸的過程中產生[20]。這些煙酰胺核苷酸在氧化形式（NAD+和NADP+）和還原形式（NADH和NADPH）之間不斷相互轉化，作為生物合成途徑中的重要輔助因子而發揮作用[8]。

2 NAD（H）的測定

NAD（H）的分布與代謝具有組織特異性，因此檢測NAD（H）的合成與消耗途徑，以及其在不同類型的細胞、組織、生理狀態和疾病中的差異具有重要意義。

引入14C標記的NR等NAD（H）前體后，測定NAD（H）標記可以量化NAD（H）的合成和消耗通量[21]。液相色譜-質譜聯用技術對NAD（H）的定量標記也具有廣泛應用前景，在研究中曾用于檢測人體活檢樣本[22]。近年來，也有研究構建出靶向線粒體的生物傳感器，通過實時成像并檢測活細胞內線粒體和細胞質中的NAD+/NADH比率，為探究NAD（H）調控不同細胞、組織和器官中的線粒體功能提供了可能[23]。

3 NAD（H）在相關疾病中的調控作用

3.1 NAD（H）調控線粒體功能在神經系統變性疾病中的作用

神經元細胞代謝功能障礙是阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森綜合征（PD）和亨廷頓?。℉D）等神經系統變性疾病發生的原因之一，大量研究證實NAD（H）代謝參與神經系統變性疾病的發生與發展過程，線粒體能量穩態的喪失是影響神經系統變性疾病的發病和進展的重要因素[24-25]。

3.1.1 AD 在AD模型中可以廣泛觀察到線粒體游離NAD（H）水平降低，有學者認為這一特征與年齡依賴性的NAMPT基因表達缺失和代謝變化相關[25-26]，也可能與糖酵解通量受損所導致的胞質NADH產生減少和線粒體碳通量供應減少相關[27]。在載脂蛋白E4（ApoE4）表達的神經元中，NAD+/NADH比值降低引起線粒體氧化磷酸化受損，ECT中線粒體復合物Ⅳ的活性降低，最終導致ATP生成能力降低，加速AD疾病進程[28]。因此，維持適當的NAD（H）水平能夠維持線粒體完整性和神經元細胞活力。

除底物水平外，NAD（H）代謝還可以通過其他途徑影響線粒體功能。NAD（H）通過調節氧化磷酸化和SIRT3～SIRT5活性在線粒體中發揮重要作用，并通過SIRT1-PGC-1α軸介導線粒體內的生物合成[25]。在AD患者中，神經元SIRT3通過在K320位點去乙酰化p53，阻止線粒體p53誘導的細胞死亡和線粒體功能障礙，從而調節線粒體活性氧（ROS）水平與耗氧量[29]。Sorrentino等[30]研究發現通過誘導應激相關的激活轉錄因子-1（ATFS-1），NR等NAD+前體能夠有效激活線粒體非折疊蛋白反應（UPRmt）和線粒體自噬途徑，從而降低AD模型中的Aβ蛋白的聚集與毒性，維持線粒體蛋白平衡。

3.1.2 PD PD患者在臨床上常表現為肌肉震顫、肌強直和運動功能減退，線粒體功能障礙是關鍵致病標志之一。Tapias等[31]研究發現氧化還原失衡和黑質紋狀體多巴胺（DA）神經變性是導致ETC復合物Ⅰ持續抑制和線粒體功能障礙的主要原因。

Schondorf等[32]研究發現NAD（H）代謝增強可以顯著改善神經元的線粒體功能。在魚藤酮誘導的PD細胞模型中，上調NAD（H）介導的SIRT3通路能夠通過保護線粒體膜電位而提高細胞存活率，減輕細胞內超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）水平并減少ROS產生[33]。Park等[34]研究發現線粒體SIRT3受AMPKα-CREB信號通路影響與PD患者α-突觸核蛋白（α-syn）聚集和DA神經元變性成負相關，從而減少α-syn所誘導的線粒體ROS。

此外，也有研究發現PINK1基因是可導致PD的致病性變異基因之一，PINK1和Parkin通過PARIS/PGC-1α軸調控線粒體生物合成并維持線粒體功能[35-36]。NAD（H）介導的SIRT3途徑可以通過結合PINK1和E3泛素蛋白連接酶Parkin（PARK2）使其去乙?；源龠M線粒體自噬[37]。3.1.3 HD HD是一種常染色體顯性遺傳性神經系統變性疾病，患者會出現運動、認知等方面的障礙；細胞代謝與線粒體功能障礙也是HD細胞中的重要特征[38]。在來源于HD患者的iPSC（HD-iPSC）細胞中，存在線粒體呼吸減弱，ATP/ADP降低，PGC-1α和復合物Ⅲ亞基表達和活性減弱等特征[39]；這可能與4號染色體短臂上亨廷頓蛋白Htt突變體降低了SIRT3的去乙?；缸饔孟嚓P，進而導致NAD（H）水平下降[29]。

目前，通過NAD（H）代謝途徑調控SIRTs介導的各項生理活動具有很大的潛力，糾正氧化還原紊亂也被認為是預防或治療神經系統變性疾病的一種潛在策略。例如，通過長期給予吩噻嗪治療可使NADH/NAD+比例正常化，從而維持線粒體完整性并保護黑質紋狀體多巴胺系統，改善大鼠的PD樣行為缺陷[31]。Zhang等[40]發現使用鳶尾素也可以通過整合素受體上調下游Akt信號通路和ERK1/2信號通路，提高線粒體復合物Ⅰ活性和mtDNA拷貝數，促進NAD+再生和ATP合成。

3.2 NAD（H）調控線粒體功能在衰老中的作用

衰老是機體內不可逆的生理過程，在生長發育達到成熟期后，人體內各組織、器官發生退行性變化導致生理功能降低和紊亂。由于合成與降解失衡，多種組織中的NAD（H）水平隨年齡增長而下降[4，41]。有研究表明，在年老或患病的動物中恢復NAD（H）水平可能通過多種作用途徑延長壽命[6，42]。

在衰老過程中，NAD（H）水平下降通過SIRTs和PARPs調節p53、NF-κB、PGC-1α和HIF-1α等信號通路，導致氧化損傷、晝夜節律異常、代謝紊亂和線粒體功能障礙[3，43]。有研究發現，在老年小鼠中PARPs異常激活能夠抑制SIRT1活性，并導致線粒體功能障礙；使用PARPs抑制劑和NAD（H）前體可以緩解這一過程[3]。在秀麗隱桿線蟲中，NAD（H）水平升高后通過SIRT2.1影響有絲分裂蛋白失衡，并通過UPRmt激活應激信號、FOXO轉錄因子DAF-16的核易位和激活延長壽命[42]。提高NAD（H）水平可以通過SIRTs途徑恢復老年小鼠的線粒體功能[3]，因此，調控線粒體NAD（H）代謝在衰老和長壽中起重要作用。

3.3 NAD（H）調控線粒體功能在心血管疾病中的作用

3.3.1 缺血再灌注 在心肌細胞中，線粒體氧化磷酸化是細胞內ATP產生的主要途徑。當血流量減少時會產生有害的細胞過程，而再灌注也導致許多獨立于凋亡和壞死組織損傷的信號通路的激活，例如介導線粒體損傷增加ROS的產生，胞質誘導的線粒體Ca2+超載，NADH/FAD氧化還原比率降低，以及線粒體通透性轉換孔（mPTP）的形成和開放等，最終導致細胞死亡[44]。

SIRT4是一種線粒體定位的sirtuin，在心臟中大量存在，其作用與調控細胞能量代謝和應激反應相關。與SIRT1和SIRT3不同，目前對SIRT4的生理機制研究相對有所欠缺。在心肌細胞缺血再灌注（IR）后，體外和體內模型中均可檢測到SIRT4下調，SIRT4過表達后心肌梗死面積和血清肌酸激酶（CK）水平降低；因此通過NAD（H）途徑激活SIRT4可能通過維持線粒體功能以及減少心肌細胞凋亡，從而保護IR損傷的心臟[11]。

還有研究發現，SIRT4過表達能夠通過抑制AKT/mTOR途徑依賴性自噬，抑制阿霉素給藥后引起的心肌細胞凋亡，從而起到心臟保護作用[15，45]。因此，繼續探索心肌細胞中SIRT4作用機制具有廣泛的研究價值，為心臟保護藥物的研發提供了新的思路。

3.3.2 糖尿病心肌?。―CM） 目前，2型糖尿病的發病率正在逐漸上升，DCM是2型糖尿病的主要并發癥之一。DCM心功能障礙與代謝異常有關，表現為NAD+/NADH比率降低、脂肪酸攝取率提高和線粒體ETC缺陷[46]。

一系列研究表明，上調SIRT3也在改善DCM線粒體功能中起關鍵作用。在db/db小鼠心臟組織中，外源性給予硫化氫（H2S）能夠恢復心肌細胞中NAD+/NADH比率，提高SIRT3的表達和活性，降低了線粒體乙?；?，從而增強了線粒體ETC活性并提高ATP生成水平[12]。鷹嘴豆黃酮粗提物（CCFE）也通過PARPs和SIRT3途徑，改善NAD+/NADH氧化還原失衡和線粒體復合物Ⅰ的功能障礙；同時降低血清中的過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）水平，并上調谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）[47]。

3.3.3 心力衰竭（HF） HF與主動脈硬化、心肌和微血管重構相關，HF的患病風險隨著年齡的增長而飆升[48]。有研究者在HF模型中發現一種獨特的蛋白質乙?；Ｊ剑丛谏溲謹当Ａ舻男牧λソ撸℉FpEF）小鼠心臟中觀察到蛋白質賴氨酸乙?；↙ysAc）升高[49]。研究表明，這一特征與NAD+/NADH比率降低、線粒體功能受損和TCA代謝物減少相關；通過補充NR可使NAD+/NADH比率正?；?，乙酰化水平降低，從而改善線粒體功能和HFpEF表型[49]。

此外，研究發現這種NAD（H）氧化還原失衡所引起的線粒體蛋白超乙酰化修飾主要通過兩種不同的機制促進心臟的病理性重構：首先，線粒體蘋果酸-天冬氨酸穿梭蛋白的高乙?；种凭€粒體中NAD（H）的氧化和運輸，導致細胞質中氧化還原的不平衡；其次，寡霉素敏感賦予蛋白的乙?；揎椩黾恿似渑c親環蛋白D的結合，增強了線粒體通透性過渡孔的敏感性[50]。

3.3.4 肥厚性心肌?。℉CM） 人類HCM是一種常見的遺傳性心肌病，以舒張功能受損和左心室不對稱肥厚為主要特征。研究表明，HCM線粒體功能障礙與心肌細胞結構破壞有關，可以通過改善NAD（H）驅動的線粒體呼吸來糾正[51]。

在HCM中還可以觀察到能量代謝紊亂，表現為ATP生成減少和涉及ATP合成的線粒體基因表達降低，如催化TCA循環的大多數基因（CS、IDH2、OGDH、SUCLA2、FH和MDH1）和參與線粒體能量代謝的關鍵基因的下調，包括ANT1（腺嘌呤核苷酸轉位酶1型）、CKM2（肌酸激酶2）等[52]。通過電子顯微鏡可以觀察到受損的線粒體比例增加，嵴密度降低，線粒體內膜腫脹及嵴密度降低[52]。

因此，線粒體能量代謝結構和功能的損傷可能是HCM功能惡化的一個重要機制，線粒體也有望成為改善或預防HCM中心臟重構的新藥物靶點。

3.4 NAD（H）調控線粒體功能在腫瘤中的作用

隨著腫瘤研究不斷深入，研究者們發現線粒體是腫瘤細胞增殖、存活和轉移的代謝樞紐，線粒體中的各種代謝途徑也能影響腫瘤的代謝和進展。例如，缺氧是大多數腫瘤微環境的顯著標志；腫瘤細胞線粒體呼吸缺陷導致NAD（H）增加，AKT信號通路激活，從而使腫瘤細胞在缺氧條件下獲得耐藥性和生存優勢[53]。

分布在線粒體上依賴NAD（H）的SIRTs與細胞自噬密切相關，根據誘導或抑制自噬的策略不同，可以對不同種類或分期的腫瘤細胞產生不同影響[15，54]。例如在腫瘤細胞中，缺氧誘導的自噬可以減少氧化損傷，促進腫瘤細胞存活[53]。而SIRT4可以通過抑制谷氨酰胺代謝激活p53蛋白的磷酸化，同時腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPK）也參與了SIRT4介導的自噬和p53磷酸化的調控，從而抑制胰腺腫瘤的發生[55]；因此線粒體NAD（H）介導的SIRT4/AMPKα/p53/自噬軸在人類胰腺導管腺癌中可能具有臨床意義。

信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）是一種參與炎癥和腫瘤發生的轉錄因子，其結構部分定位于線粒體；有研究表明，STAT3在三陰性乳腺癌中起著重要的促癌作用，當STAT3缺失時復合物Ⅰ活性降低，導致NAD（H）再生受損，從而抑制抗氧化基因的表達[56]。

廣泛研究證實，調控NAD（H）代謝途徑是抑制腫瘤細胞增殖和轉移，促進細胞凋亡的有效方法。Zhang等[57]研究發現在前列腺癌細胞中敲低ACACA基因（編碼乙酰輔酶A羧化酶α形式的基因），能夠提高NAD+/NADH比率和ROS水平，減少線粒體ATP生成，從而減小腫瘤體積與重量。腫瘤干細胞高度依賴氧化磷酸化獲得能量，因此靶向氧化磷酸化或相關基因、相關酶的抑制劑被認為可以有效殺滅腫瘤干細胞[53，58]。例如，小分子化合物DX2-201通過抑制氧化磷酸化并直接結合線粒體復合物Ⅰ的NDUFS7亞基，可以實現對胰腺癌的有效治療[59]。

綜上所述，探究線粒體NAD（H）在腫瘤代謝和進展中的作用，有利于了解腫瘤發生機制并開發新的治療策略。

3.5 NAD（H）調控線粒體功能在肝臟疾病中的影響

在肝組織中，端粒功能障礙和p53通過p53依賴性抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物-1α/β（PGC-1α/β）機制下調線粒體SIRTs；補充NAD（H）后可逆轉肝組織中p53、FOXO1、PGC-1α、SOD2和CPS1等SIRTs靶點的超乙?；?，從而穩定端粒并改善肝纖維化[60]。此外，依賴NAD（H）的SIRT3能夠通過肝細胞中AMPK-UNC51樣激酶1（ULK1）途徑，促進脂滴自噬降解，促進脂滴在去酪氨酸微管上分散，抑制硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）表達從而抑制脂肪生成，使長鏈酰基輔酶A脫氫酶（LCAD）去乙?；?，增強線粒體脂肪酸氧化，從而改善肝細胞中的脂肪毒性，在非酒精性脂肪肝病中發揮保護作用[61]。

此外，Katsyuba等[62]發現ACMSD主要表達于腎臟和肝臟，表明ACMSD是肝腎細胞NAD（H）水平、SIRTs活性和線粒體穩態的關鍵調節劑。在NR誘導肝細胞NAD（H）合成的過程中，煙酰胺核苷激酶1（NRK1）是限速酶；Sambeat等[63]發現NRK1缺乏會導致糖異生潛能降低和PARP1活性受損，因此更容易受到飲食誘導的肝臟DNA損傷。因此，調控NAD（H）代謝途徑的關鍵酶和信號通路也可以作為肝臟疾病防治的潛在靶點。

4 總結與展望

綜上所述，NAD（H）通過調節生物體內的氧化還原平衡、基因表達、細胞能量代謝和SIRTs等NAD（H）依賴酶的活性來影響線粒體的結構與功能，從而在疾病的發生發展中發揮重要調節作用。已有研究應用NAD（H）增強劑調節線粒體功能，旨在治療NAD（H）缺乏的相關疾病或延長生物體壽命。例如，給予NAD（H）前體NR可以使AD小鼠神經細胞線粒體SIRT3活性增加，從而改善認知功能[13]。

但目前，研究者對NAD（H）在體內的藥代動力學仍知之甚少，也仍需通過更多研究確定不同NAD（H）前體的特定效應分子。因此在臨床治療中有必要針對不同的人類疾病和人群特征對NAD（H）增強劑的療效、治療劑量和給藥途徑進行優化，從而提高治療效果。同時，NAD（H）介導的線粒體代謝研究也需要不斷深入，通過探究NAD（H）在不同疾病狀態下調控線粒體功能的復雜機制和潛在的藥物治療靶點，為以NAD（H）為核心的疾病預防和診療研究提供新的思路。