FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2聯合診斷胃癌的臨床價值及機制研究

徐雪瑩,章 燕,鐘 峰,葉 開,唐曉磊

(皖南醫學院第二附屬醫院 1.檢驗科;2.醫學轉化中心,安徽 蕪湖 241000)

胃癌是全球第三大致死性惡性腫瘤,每年新增病例超過100萬[1]。由于胃癌早期缺乏明顯及特異性的臨床癥狀,大多數患者在確診時已經處于晚期,往往錯過根治性切除的機會,或存在術后轉移和復發的高風險[2]。因此,提高胃癌早期診斷率已成為當今臨床亟需解決的問題。

大量研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在腫瘤患者組織及體液中異常表達,并參與調控癌癥的發生發展[3]。Tong等研究發現lncRNA在血漿中能夠穩定存在,使其可以用作腫瘤診斷及預后判斷的標志物[4-5]。于純良等發現PIK3CA等循環腫瘤DNA在胃癌患者外周血中的檢出率高于胃癌組織,為胃癌患者的精準靶向治療提供了依據[6]。本研究篩選并分析了3種lncRNA聯合診斷胃癌的臨床價值,并選擇HOXC-AS2進行下游靶基因預測以及PPI蛋白互作分析,構建HOXC-AS2-miRNA-mRNA調控網絡,以期為胃癌的早期診斷提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 數據下載 從癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中下載胃癌的RNA-seq測序數據及患者相關臨床信息,其中包括腫瘤樣本375例,正常樣本32例。從基因表達綜合(GEO)數據庫中下載GSE184336(230例配對的胃癌/正常胃組織)和GSE179252(38例配對的胃癌/正常胃組織)數據集。

1.2 患者樣本 收集2020年9月～2021年11月于皖南醫學院第二附屬醫院就診的胃癌患者50例,男35例,女15例,年齡46～88歲,中位年齡64歲。納入標準:①經組織切片病理檢查確診為胃癌;②納入前均未進行手術、放化療及其他輔助治療等;排除標準:排除糖尿病、嚴重肝腎功能不全、感染、血液系統疾病或其他惡性腫瘤疾病患者。收集同期年齡和性別匹配的胃良性疾病(胃炎、胃潰瘍等)患者和健康體檢者各50例。本研究經皖南醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準,患者均知情同意。

1.3 血清樣本采集及處理 采集各研究對象治療前(健康體檢者于體檢時)空腹靜脈血2 mL,4℃、3 000×g離心10 min分離血清,4℃、12 000×g離心10 min以去除細胞碎片,血清分裝后置于-80℃保存。

1.4 RNA提取及qRT-PCR反應 按miRNeasy Serum/Plasma kit(美國Qiagen公司)說明書提取血清總RNA,利用逆轉錄試劑盒(美國Qiagen公司)將RNA逆轉錄為cDNA。根據2×SYBR Green PCR Master Mix(北京康為世紀公司)說明書配置反應體系,采用ABI 7500熒光定量PCR檢測系統(美國ABI公司)進行分析。qRT-PCR條件:95℃預變性15 min;94℃ 20 s,55℃ 20 s,72℃ 20 s,共40個循環。以U6為內參,采用-ΔCt值表示lncRNA相對表達量。ΔCt=樣本Ct目的基因-樣本Ct管家基因。利用Primer Premier 5.0軟件設計引物,并由蘇州金唯智公司合成,引物序列見表1。

表1 各基因引物序列及產物大小

1.5 數據處理 使用R語言的limma包分析相對于癌旁正常組織,胃癌組織中失調的lncRNA,以|log2FC|>2和P<0.05為條件篩選差異表達的lncRNA。LncBase和miRDB數據庫預測HOXC-AS2下游靶基因。String數據庫分析蛋白之間的相互作用,通過Cytoscape 3.9.1軟件繪圖。

1.6 診斷模型建立及評估 以TCGA-STAD、GSE179252、GSE184336數據集和本院患者的樣本為研究對象,所選lncRNA表達水平作為自變量,將組織/血清是否來源于胃癌定義為因變量,進行二分類Logistic回歸分析得到回歸方程,算得聯合檢測的預測概率值并繪制受試者工作特征(ROC)曲線判斷其診斷價值。

1.7 統計學分析 采用SPSS 18.0及Graphpad Prism 7.0統計軟件進行分析,計量資料采用F檢驗(兩兩比較q檢驗)分析受檢者血清中所選lncRNA的表達差異,并采用二分類Logistic回歸分析建立診斷模型。采用等級相關系數分析lncRNA表達與臨床病理參數相關性。采用ROC曲線分析所選lncRNA單獨及三者聯合檢測胃癌的診斷價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 篩選差異表達的lncRNA 與癌旁正常組織相比,胃癌組織中有1 518個基因表達失調,包括145個上調lncRNA和66個下調lncRNA,見圖1。

A.熱圖列出前100個基因;B.火山圖。

2.2 建立lncRNA診斷模型 對211個差異表達的lncRNA進行ROC曲線分析,選取ROC曲線下面積(AUC)>0.95的3個基因——MIR4435-1HG、FOXD2-AS1和HOXC-AS2進行后續分析(表2)。

表2 差異表達的lncRNA ROC分析結果

2.3 FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2單獨及聯合檢測胃癌的診斷價值 在TCGA-STAD數據庫中,FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2單獨檢測均表現出較高的靈敏度和特異度,三者聯合檢測的AUC為0.994,靈敏度98.4%,特異度100%。在GSE179252和GSE184336數據集中,三者聯合檢測也表現出較好的診斷效能,AUC分別為0.958和0.921,靈敏度、特異度分別達到89.5%、97.4%和83.1%、93%,見表3及圖2。

表3 各數據庫中lncRNA聯合檢測的診斷效能

圖2 FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2單獨及聯合檢測診斷胃癌的ROC曲線

A.F=18.996,P<0.001;B.F=24.685,P<0.001;C.F=16.137,P<0.001。

2.4 FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2聯合檢測在血清中的診斷價值 進一步驗證3個lncRNA在血清中的診斷效能。結果顯示,與健康體檢者相比,MIR4435-1HG在胃良性疾病患者血清中表達上調(P<0.05),FOXD2-AS1和HOXC-AS2在兩組研究者中表達量差異無統計學意義(P>0.05)。相較于胃良性疾病患者,FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2在胃癌患者血清中表達升高P<0.001)。Logistic回歸分析得到聯合檢測回歸方程為:Logit(P)=7.3+0.587×FOXD2-AS1+0.384×MIR4435-1HG+0.121×HOXC-AS2,見表4。三者聯合檢測的AUC為0.843,靈敏度和特異度分別為80%和86%,見表5。

表4 lncRNA聯合檢測的Logistic模型參數

表5 lncRNA聯合檢測在血清中的診斷效能

2.5 HOXC-AS2與胃癌患者臨床病理參數相關性 在TCGA-STAD數據庫中,HOXC-AS2與胃癌患者年齡、性別、T分期、N分期、M分期、TNM分期相關性均無統計學意義(P>0.05);與腫瘤分級相關(P<0.05),見表6。

2.6 HOXC-AS2下游靶基因預測 LncBase和miRDB數據庫預測結果顯示HOXC-AS2可與下游mRNA競爭性結合miR-9-5p、miR-675-5p、miR-27a-5p、miR-148a-3p、miR-148b-3p、miR-139-5p、miR-1180-3p位點,從而調控胃癌進展(圖4)。

2.7 PPI蛋白互作分析 String數據庫分析結果顯示DLX6與HOXC家族之間的相互作用關系共同構成了HOXC-AS2相關蛋白互作網絡(圖5)。

圖5 HOXC-AS2潛在靶基因編碼蛋白質的PPI網絡

3 討論

近年來,lncRNA作為癌癥早期篩查、診斷、判斷預后和監測藥物治療效果的生物標志物已引起廣泛關注[7-8]。研究表明,lncRNA-LET、PVT1、PANDAR、PTENP1和LINC00963的聯合檢測可作為診斷腎透明細胞癌及其預后評價的有效生物標志物[9]。陳勇等發現Lnc01317和Lnc00886在胃癌患者血液中低表達,其作為診斷標志物的AUC分別為0.823和0.743,靈敏度、特異度為75%、86.7%和55%、90%[10],。然而,仍有許多在胃癌中異常表達的lncRNA可能因AUC值過低無法區分胃癌患者與健康體檢者,從而限制了其臨床應用。因此,發現具有更高靈敏度和特異度的lncRNA及其聯合檢測用作胃癌診斷的生物標志物非常重要。

本研究在TCGA數據庫中篩選出3個在胃癌中差異性表達的lncRNA——FOXD2-AS1、MIR4435-1HG、HOXC-AS2。三者聯合檢測胃癌的AUC為0.994,靈敏度98.4%,特異度100%。在GSE184-336和GSE179252數據集中,三者聯合檢測也表現出較好的診斷效能,AUC分別為0.921和0.958,靈敏度、特異度分別達到83.1%、93%和89.5%、97.4%。進一步驗證FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2在50例胃癌患者、胃良性疾病患者及健康體檢者血清中的表達水平,結果與胃癌組織中的表達一致,三者聯合檢測的AUC為0.843,靈敏度和特異度分別為80%和86%。以上結果表明,FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2 三者聯合檢測能夠較好地區分胃癌與非胃癌患者,具有較強的特異診斷價值。

已有研究表明FOXD2-AS1在骨肉瘤、胃癌、宮頸癌、喉癌等多種腫瘤中表達上調,與患者的不良預后密切相關[11-14]。黃振華等發現MIR4435-1HG在胃癌患者血清中呈高表達,且與淋巴結轉移、浸潤深度和TNM分期相關[15],Gao等發現MIR4435-1HG分子通過調控miR-138-5p/Sox4軸抑制胃癌細胞的侵襲、遷移和EMT過程[16]。然而對于HOXC-AS2的研究甚少,因此選擇HOXC-AS2進行后續分析。結果發現HOXC-AS2在胃癌組織中表達上調,其表達量與胃癌患者的腫瘤分級相關。研究發現HOXC-AS2主要定位在子宮內膜癌和膠質瘤細胞的胞質中[17-18],同時越來越多的證據表明胞質中的lncRNA可作為ceRNA分子吸附miRNA從而發揮其保護下游靶基因的功能[19]。通過預測與HOXC-AS2位點互補結合的miRNA發現,HOXC-AS2可發揮分子海綿作用與下游mRNA競爭性結合miR-9-5p、miR-675-5p、miR-27a-5p、miR-148a-3p等位點,調控DLX6與HOXC蛋白家族之間的相互作用,從而加速胃癌進展。

綜上所述,血清中的FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2可用作胃癌檢測的新型診斷標志物,3種lncRNA聯合檢測可以提供足夠高的診斷準確性,為胃癌的早期診斷提供實驗室依據。同時,生物信息學分析顯示HOXC-AS2可作為ceRNA促進胃癌進展,后續可通過實驗進一步驗證。