lncRNA HOTAIR作為肺鱗癌預(yù)后標(biāo)記物的生物信息學(xué)研究

殷國(guó)泉,呂 坤

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 1.中心實(shí)驗(yàn)室;2.檢驗(yàn)科,安徽 蕪湖 241001)

世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,每年約有200萬(wàn)人被診斷為肺癌,其死亡人數(shù)約占癌癥總死亡人數(shù)的18%[1-2]。中國(guó)東部和城市地區(qū)的肺癌發(fā)病率較高,其中吸煙、長(zhǎng)期接觸惰性氣體、空氣污染都是導(dǎo)致肺癌的高危因素[3-4]。非小細(xì)胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌[5],大約占所有肺癌病例的85%。肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)常見(jiàn)于中央型肺癌,早期常引發(fā)支氣管狹窄,甚至可以發(fā)展為阻塞性肺炎[6]。LUSC預(yù)后不佳是目前的棘手問(wèn)題,詳細(xì)了解LUSC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制對(duì)于改善該病生存率至關(guān)重要。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA[7],一般無(wú)蛋白編碼能力。研究表明,lncRNA異常表達(dá)往往與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-9]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR(long non-coding RNA HOTAIR,HOTAIR)[10]在多種癌癥中發(fā)揮重要作用。Liu等[11]研究表明,HOTAIR在NSCLC組織中顯著上調(diào),并通過(guò)下調(diào)HOXA5影響NSCLC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。推測(cè)HOTAIR可能代表預(yù)后不良的新標(biāo)志物,并且是NSCLC干預(yù)的潛在治療靶點(diǎn)。此外有研究報(bào)道VPS9D1-AS1、MALAT-1等lncRNA與LUSC患者的生存相關(guān)[12-13]。HOTAIR在LUSC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用仍有待充分研究。

本研究采用lncRNA轉(zhuǎn)錄組范圍的微陣列方法,探討HOTAIR在LUSC發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后過(guò)程中的具體功能,為后續(xù)探討其機(jī)制,尋找潛在的分子標(biāo)志物及藥物治療靶點(diǎn)提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)處理及分析 通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析33種癌癥中HOTAIR的表達(dá)情況;在癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載配對(duì)及非配對(duì)LUSC患者項(xiàng)目中l(wèi)evel 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù),利用R語(yǔ)言軟件中的R包,主要為ggplot2(用于可視化),將FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成TPM格式并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化,采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.linkedomics.org/login.php)下載LUSC中共表達(dá)HOTAIR基因,通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)確定HOTAIR共表達(dá)基因,篩選出正負(fù)相關(guān)的前50個(gè)基因,通過(guò)熱圖及數(shù)據(jù)分析展示結(jié)果,利用基因集合富集分析探索HOTAIR及其共表達(dá)基因的基因本體生物學(xué)過(guò)程(GO_BP)和KEGG通路。

1.2 HOTAIR表達(dá)差異與臨床參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系 下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中LUSC臨床數(shù)據(jù),根據(jù)中位數(shù)將數(shù)據(jù)分為高、低表達(dá)HOTAIR組,對(duì)下載的臨床數(shù)據(jù)采用回歸模型進(jìn)一步分析HOTAIR表達(dá)水平與LUSC臨床病理特征之間的關(guān)系,survival包分析HOTAIR與整體生存期(overall survival,OS)、疾病特異性生存期(disease specific survival,DSS)、無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)的關(guān)系。

1.3 LUSC中共表達(dá)基因數(shù)據(jù)篩選富集及免疫分析 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)確定HOTAIR的共表達(dá)基因,篩選出正、負(fù)相關(guān)的前50個(gè)基因,并通過(guò)熱圖和火山圖顯示結(jié)果。本研究利用基因集富集分析(GSEA)探索HOTAIR及其共表達(dá)基因的GO_BP和KEGG路徑。免疫浸潤(rùn)算法使用ssGSEA(GSVA包內(nèi)置算法);使用TIMER軟件驗(yàn)證不同HOTAIR mRNA表達(dá)水平與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中LUSC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載HTSeq-FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù),采用秩和檢驗(yàn)分析HOTAIR在LUSC中的表達(dá)情況;采用Cox回歸分析HOTAIR表達(dá)水平與LUSC臨床病理特征之間的關(guān)系,survival包用于生存資料的統(tǒng)計(jì)分析及可視化。LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.linkedomics.org/login.php)下載LUSC中共表達(dá)HOTAIR基因,通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)確定HOTAIR共表達(dá)基因。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR在泛癌中的表達(dá)情況 從TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)下載并分析HOTAIR在34種常見(jiàn)癌癥中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示HOTAIR在乳腺癌、膽管癌、結(jié)腸癌、食管癌、頭頸鱗癌、腎透明細(xì)胞癌、肺鱗癌等多種癌癥中表達(dá)上調(diào),僅在腎嫌色細(xì)胞癌中低表達(dá)(圖1)。

圖1 HOTAIR在泛癌中的表達(dá)情況

2.2 HOTAIR在LUSC中的表達(dá)情況 通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中LUSC數(shù)據(jù)處理分析,可以看出551對(duì)非配對(duì)LUSC樣本中(包括49例正常樣本及502例腫瘤樣本)HOTAIR在腫瘤組織中高表達(dá)(t=5.220,P<0.001,圖2A);在49對(duì)配對(duì)LUSC樣本中,HOTAIR在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)(t=4.138,P<0.001,圖2B);分析HOTAIR在LUSC中的診斷價(jià)值,受試者工作特征(ROC)曲線(xiàn)下面積(AUC)=0.883(95%CI:0.854～0.912);靈敏度為0.939,特異度為0.779(圖2C)。

A.非配對(duì)LUSC患者中HOTAIR表達(dá)情況(n=551;P<0.001);B.LUSC患者及其配對(duì)正常組織中HOTAIR的表達(dá)情況(n=49;P<0.001);C.LUSC患者中HOTAIR的ROC分析(n=551)。

2.3 HOTAIR表達(dá)情況與LUSC患者的臨床特征之間的關(guān)系 通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),將LUSC患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,將502例患者按中位數(shù)分為高、低表達(dá)兩組,進(jìn)行臨床病理特征分析時(shí),剔除臨床性狀未知的標(biāo)本。結(jié)果顯示,HOTAIR表達(dá)與患者的病理分級(jí)密切相關(guān)(P<0.05,表1)。

表1 HOTAIR表達(dá)與LUSC患者臨床病理特征之間的關(guān)系[n=502,n(%)]

2.4 HOTAIR表達(dá)與LUSC患者預(yù)后之間的關(guān)系 剔除TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中因隨訪(fǎng)資料缺失及預(yù)后資料缺失的數(shù)據(jù),用survminer包以及survival包進(jìn)行數(shù)據(jù)的可視化及數(shù)據(jù)分析,將496例LUSC患者分為高、低表達(dá)HOTAIR兩組(其中高表達(dá)組314例;低表達(dá)組182例),結(jié)果顯示,與低表達(dá)HOTAIR組相比,高表達(dá)HOTAIR組的LUSC患者遠(yuǎn)期生存預(yù)后不理想。高表達(dá)HOTAIR組患者的總體生存預(yù)后較差,其中位生存時(shí)間為44.9個(gè)月;低表達(dá)HOTAIR組患者的中位生存時(shí)間為72.0個(gè)月(HR=1.41;95%CI:1.06～1.89;P=0.020),見(jiàn)圖3A;患者的DSS結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.263),高表達(dá)HOTAIR患者的生存預(yù)后較差,見(jiàn)圖3B;高表達(dá)HOTAIR的患者生存預(yù)后也較差,其中高表達(dá)組中位生存時(shí)間為26.6個(gè)月,低表達(dá)組中位生存時(shí)間為40.1個(gè)月,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.36;95%CI:1.04～1.78;P=0.022),見(jiàn)圖3C。HOTAIR的表達(dá)可能會(huì)影響LUSC患者的生存預(yù)后。

2.5 HOTAIR共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)及其富集分析 在LUSC中,1 396個(gè)基因(深紅點(diǎn))與HOTAIR呈正相關(guān),1 143個(gè)基因(深綠點(diǎn))與HOTAIR呈負(fù)相關(guān)(圖4)。熱圖顯示了與HOTAIR呈正、負(fù)相關(guān)的前50個(gè)基因(圖5A、B)。通過(guò)GO/KEGG富集分析確定HOTAIR共表達(dá)基因的GO富集,發(fā)現(xiàn)HOTAIR及其共表達(dá)的正相關(guān)基因主要富集在DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、增強(qiáng)子結(jié)合、增強(qiáng)子序列特異性、DNA結(jié)合、胚胎骨骼系統(tǒng)的發(fā)育、骨骼系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)生等生物過(guò)程(圖5C、D)。負(fù)相關(guān)基因主要富集在中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中性粒細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞脫顆粒等生物過(guò)程(圖5E、F)。這些結(jié)果表明,HOTAIR的表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)而在LUSC中發(fā)揮重要作用。

A.與HOTAIR正相關(guān)的前50個(gè)基因熱圖;B.與HOTAIR負(fù)相關(guān)的前50個(gè)基因熱圖;C、D.正相關(guān)基因的GO/KEGG富集分析;E、F.負(fù)相關(guān)基因的GO/KEGG富集分析。

2.6 HOTAIR表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系 考慮到GO和KEGG富集分析都發(fā)現(xiàn)HOTAIR可能參與了腫瘤免疫應(yīng)答,本研究進(jìn)一步應(yīng)用ssGSEA分析了HOTAIR表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的關(guān)系(圖6A)。此外通過(guò)TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析HOTAIR表達(dá)與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系,本研究分析了常見(jiàn)的幾種免疫細(xì)胞與HOTAIR的關(guān)系,可以看出,HOTAIR的表達(dá)與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞呈明顯正相關(guān),而與中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(圖6B)。

A.免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與HOTAIR表達(dá)的相關(guān)性;B.HOTAIR的表達(dá)與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的相關(guān)性。

3 討論

LncRNA HOTAIR已被證實(shí)通過(guò)影響細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移在癌癥中發(fā)揮重要作用[14-16]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析方法,尋找LUSC與癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNA,在泛癌癥分析中,發(fā)現(xiàn)HOTAIR在大多數(shù)癌癥類(lèi)型中均上調(diào)。進(jìn)一步探討發(fā)現(xiàn),HOTAIR的高表達(dá)與LUSC患者的OS降低有關(guān)。通過(guò)Logistic回歸分析來(lái)評(píng)估HOTAIR的表達(dá)水平與LUSC的臨床病理特征之間的關(guān)系,結(jié)果顯示HOTAIR與臨床分期顯著相關(guān)。以上結(jié)果和ROC分析表明,HOTAIR可能是LUSC患者的一個(gè)預(yù)后生物標(biāo)志物。

本研究的基因富集分析表明,HOTAIR的主要生物學(xué)功能是參與免疫應(yīng)答。為了證實(shí)HOTAIR表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān),本研究假設(shè)HOTAIR可能通過(guò)改變特定免疫細(xì)胞類(lèi)型的比例來(lái)影響腫瘤微環(huán)境,從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。有研究[17]發(fā)現(xiàn),HOTAIR參與巨噬細(xì)胞的功能、遷移和分化,最近的研究[18]也表明,HOTAIR對(duì)M2樣巨噬細(xì)胞(腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞)至關(guān)重要,并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。由此可見(jiàn),HOTAIR是維持腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。本研究表明巨噬細(xì)胞與HOTAIR的表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系。腫瘤微環(huán)境在其調(diào)節(jié)方面具有高度的復(fù)雜性,腫瘤微環(huán)境中的其他免疫細(xì)胞類(lèi)型也可能影響腫瘤細(xì)胞的存活,包括中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD56細(xì)胞、Th1細(xì)胞、DC和pDC。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步探索HOTAIR表達(dá)與這些細(xì)胞之間的關(guān)系。

綜上所述,本研究證明了HOTAIR表達(dá)在LUSC中上調(diào),并且與不良生存預(yù)后顯著相關(guān)。HOTAIR可能通過(guò)影響免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平參與LUSC的發(fā)生和發(fā)展。本研究揭示了HOTAIR在LUSC中的作用,并有希望成為L(zhǎng)USC預(yù)后生物標(biāo)志物。