miR-483-5p促進膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲

程 超,汪家偉,王國偉,汪 浩,黃后寶,李亞偉

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 泌尿外科,安徽 蕪湖 241001;2.中山大學附屬第五醫(yī)院 泌尿外科,廣東珠海 519000)

膀胱癌是全球最常見的癌癥之一。在中國,膀胱癌在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的病死率和發(fā)病率最高[1-2]。與非肌層浸潤性膀胱癌患者(70%)相比,肌層浸潤性膀胱癌患者(30%)更易發(fā)生轉移且預后較差[3-4]。即使肌層浸潤性膀胱癌患者經(jīng)過了最佳治療,其5年總生存率也會因遠處轉移的影響而僅有50%[5]。因此,闡明膀胱癌進展的分子機制對于開發(fā)更加有效的抗癌療法具有重要的臨床意義。

微RNA(MicroRNA,miRNA)的表達失調與多種癌癥的發(fā)生有關[6-7]。研究表明,miRNA可以作為潛在的治療方法,包括使用miRNA模擬物進行miRNA替代療法或抗miRNA來抑制miRNA功能[8],這些方法在臨床上已經(jīng)顯示出很大的應用價值[9]。已有文獻報道m(xù)iR-483-5p參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,如靶向KCNQ1促進食道癌進展[10],靶向DAPK1降低鼻咽癌細胞的放射敏感性[11],抑制miR-483-5p可抑制三陰性乳腺癌細胞的進展和炎癥反應[12]。miR-483-5p在膀胱癌中的作用尚不清楚,本研究旨在探討miR-483-5p在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其可能的分子機制。

A.miR-483-5p抑制劑的轉染效率;B、C.CCK-8實驗顯示膀胱癌細胞的活力;D～G.EdU實驗顯示膀胱癌細胞的增殖能力。**P<0.01。

1 材料與方法

1.1 組織樣本 本研究收集弋磯山醫(yī)院泌尿外科就診患者中30對膀胱癌組織及其對應的正常組織。所有參與者均簽署知情同意書,并經(jīng)皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 細胞培養(yǎng) 人膀胱癌細胞系(EJ和T24)在Gibco公司的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),人正常尿路上皮細胞(SV-HUC-1)在F-12K完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細胞系均在37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

1.3 RNA提取和實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) 本研究采用TRIzol試劑(Invitrogen)從膀胱癌組織和細胞中提取總RNA,然后使用miRNA first-strand cDNA試劑盒將提取的總RNA反轉錄。接著,使用PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒合成miRNA的互補DNA(complementary DNA,cDNA),并使用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達。miR-483-5p和PTGIS引物均由銳博公司設計。

1.4 泛癌表達分析 為了研究不同類型癌癥的RNA表達譜,本研究使用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.com),該數(shù)據(jù)庫提供了33種腫瘤類型的RNA測序數(shù)據(jù)(3級)和相關臨床信息。

1.5 細胞轉染 本研究使用的miR-483-5p抑制劑(inhibitor)和陰性對照(negative control,NC)寡核苷酸購自RiBoBio(中國)。根據(jù)說明書,本研究在DMEM培養(yǎng)基中使用Lipofectamine 8000(Beyotime,中國)進行瞬時轉染。

1.6 細胞活力、增殖、遷移和侵襲試驗 本研究使用BestBio公司的細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)檢測細胞的活力。為了評估細胞的增殖能力,在轉染48 h后,將低密度的細胞(20 000個細胞/板)接種在96孔板中,然后根據(jù)5-乙基-20-脫氧尿苷(5-ethynyl-20-deoxyuridine,EdU)試劑盒(RiboBio,中國)說明書進行下一步實驗。在侵襲試驗中,將5×104個轉染miR-483-5p抑制劑的膀胱癌細胞在涂有Matrigel(BD Bioscience,美國)的上腔中接種,隨后在下層補充500 μL含有10% FBS的培養(yǎng)基,并在下層孔中培養(yǎng)24 h。在評估細胞侵襲能力時,在3個隨機區(qū)域進行細胞計數(shù)。

1.7 雙熒光素酶報告 基因檢測EJ和T24細胞與miR-483-5p模擬物和含有前列環(huán)素合成酶(prostacyclin synthase,PTGIS)野生型(Wild-type,wt)或PTGIS突變型(Mutant,mut)3′-UTR的熒光素酶報告載體(GenePharma,中國)通過lipofectamine 8000進行共轉染。轉染6 h后更換培養(yǎng)基,孵化36 h后裂解細胞。最后檢測熒光素酶活性。

1.8 蛋白質印記技術 在細胞中加入含有通用蛋白酶抑制劑(Beyotime,中國)的RIPA緩沖液(Beyotime,中國)。然后,用離心法獲得總蛋白,BCA法(Beyotime,中國)測定總蛋白濃度。電泳后,將總蛋白轉移到厚度為0.45 mm的PVDF膜上。隨后將PVDF膜置于阻斷液中1 h,然后將膜與PTGIS(1∶5 000,Abcam,英國)和GAPDH抗體(1∶5 000,Affinity,美國)在4℃下培養(yǎng)過夜。隨后,將膜浸泡在二抗(Bosterbio,美國)中1 h。最后使用ChemiDoc Touch系統(tǒng)(Bio-Rad,美國)曝光所有的條帶。

2 結果

2.1 miR-483-5p在泛癌中的表達 基于TCGA數(shù)據(jù)庫,本研究評估了miR-483-5p在不同癌癥組織中的表達情況。結果顯示,在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、結腸癌(COAD)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSC)、食管癌(ESCA)、嗜鉻細胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(PCPG)以及胃腺癌(STAD)中,miR-483-5p的表達升高(P<0.05,見圖1);在乳腺浸潤癌(BRCA)、肝細胞肝癌(LIHC)、膽管癌(CHOL)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、腎透明細胞癌(KIRC)、腎嫌色細胞癌(KICH)、甲狀腺癌(THCA)以及子宮內膜癌(UCEC)中,miR-483-5p的表達下降(P<0.05,見圖1)。

2.2 miR-483-5p在膀胱癌組織和細胞中的表達水平 本研究采用qRT-PCR檢測了30對膀胱癌樣本中miR-483-5p的表達水平,并與相應的癌旁組織進行比較。結果表明,與膀胱癌癌旁組織相比,miR-483-5p的表達升高(t=-4.782,P<0.01;圖2A)。與SV-HUC-1細胞相比,EJ和T24細胞中miR-483-5p的表達水平升高(F=23.233,P<0.01;圖2B)。

2.3 miR-483-5p在膀胱癌中的診斷價值與預后意義 ROC曲線顯示,在預測膀胱癌結局方面,miR-483-5p的預測能力有一定準確性(AUC=0.746,95%CI:0.660～0.833;圖3A)。通過Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)數(shù)據(jù)庫預后價值分析,我們發(fā)現(xiàn)高表達miR-483-5p的患者預后更差,miR-483-5p高表達是膀胱癌患者預后的獨立危險因素(HR=1.39,95%CI:1.03～1.87,P=0.032;圖3B)。

2.4 miR-483-5p的下調抑制了膀胱癌細胞的增殖 我們檢測了miR-483-5p抑制劑(miR-483-5p inhibitor)的轉染效率,結果顯示轉染后EJ和T24細胞表達miR-483-5p的水平降低(t=6.059、6.632,P<0.01;圖4A)。CCK-8實驗結果表明,與miR-483-5p對照(inhibitor NC)組相比,miR-483-5p inhibitor組的EJ和T24細胞活力下降(t=7.593、7.461,P<0.01;圖4B、C)。EdU實驗表明,與inhibitor NC組相比,miR-483-5p inhibitor組的EJ和T24細胞增殖能力下降(t=7.923、6.694,均P<0.01;圖4D～G)。

2.5 miR-483-5p的下調抑制了膀胱癌細胞的遷移和侵襲 劃痕實驗結果表明,與inhibitor NC組相比,miR-483-5p inhibitor組EJ和T24細胞遷移率下降(t=15.232、11.565,P<0.01;圖5A、B)。Transwell侵襲實驗顯示,與inhibitor NC組相比,miR-483-5p inhibitor組的EJ和T24細胞進入下室的細胞量下降(t=15.384、24.333,P<0.01;圖5C、D)。

A、B.劃痕實驗顯示膀胱癌細胞遷移能力;C、D.Transwell侵襲實驗顯示膀胱癌細胞的侵襲能力。**P<0.01。

2.6 PTGIS是miR-483-5p的靶標 為了尋找miR-483-5p的潛在下游靶標,本研究使用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)、ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/)和miRwalk(http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/miRwalk/)miRNA數(shù)據(jù)庫并與膀胱癌GSE52519數(shù)據(jù)集中表達下降的基因(P<0.05,logFC<-2)取交集。PTGIS是交集中的一個基因(圖6A)。圖6B顯示了PTGIS mRNA與miR-483-5p的結合位點和突變位點。我們觀察到與模擬物-NC(mimics-NC)相比,含有PTGIS-wt的熒光素酶報告載體與miR-483-5p模擬物(miR-483-5p-mimics)共轉染會明顯降低PTGIS-wt載體的熒光素酶活性,而轉染miR-483-5p模擬物后的細胞中含有PTGIS-mut的熒光素酶活性沒有受到影響(t=6.797、11.567,P<0.01;圖6C、D)。與inhibitor NC組相比,miR-483-5p inhibitor明顯提高了EJ和T24細胞中PTGIS mRNA的表達水平(t=12.723、14.747,P<0.01;圖6E)。PTGIS蛋白的表達水平在miR-483-5p表達受到抑制后也上升(t=17.537、12.926,P<0.01;圖6F)。

A.PTGIS由TargetScan、ENCORI和mirwalk數(shù)據(jù)庫結合GSE52519數(shù)據(jù)集篩選出來。圖中的4個橢圓分別代表TargetScan、ENCORI和mirwalk數(shù)據(jù)庫以及GSE52519數(shù)據(jù)集的預測結果;B.miR-483-5p與PTGIS結合點的生物信息學預測;C、D.雙熒光素酶實驗顯示,miR-483-5p降低了PTGIS-wt熒光素酶報告基因的熒光素酶活性(**P<0.01);E、F.在被miR-483-5p抑制劑轉染的EJ和T24細胞中,PTGIS mRNA(E)和蛋白(F)表達上升(**P<0.01)。

3 討論

miRNA是一種單鏈非編碼RNA分子,其長度通常為18～25個堿基,通過與基因編碼序列或3′非翻譯區(qū)(3′UTR)結合來調節(jié)基因的表達[13]。多項研究表明,miRNA在細胞的增殖、遷移和其他重要的細胞過程中發(fā)揮了至關重要的作用[14]。在腫瘤學領域中,因為miRNA被認為是潛在的癌癥生物標志物和治療靶點,所以miRNA一直是研究的熱點之一[15-16]。Wang等發(fā)現(xiàn)miR-483-5p下調有助于腎透明細胞癌的細胞增殖、轉移和炎癥[17],Agosta等發(fā)現(xiàn)miR-483-5p通過靶向N-myc來促進腎上腺皮質癌中的侵襲性[18]。然而,迄今為止,還未有研究報道m(xù)iR-483-5p在膀胱癌中的表達與生物學功能。

本研究中,我們進行了生物信息學分析,研究了TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-483-5p在泛癌中的表達情況。結果顯示,miR-483-5p在6種癌癥中的表達升高,而在另外8種癌癥中,miR-483-5p的表達下降。這表明miR-483-5p在癌癥中可能具有雙重作用。已有的多項研究與我們的預測結果一致[10,17,19-20],證明了我們預測結果的可靠性。qRT-PCR檢測的結果表明,miR-483-5p在膀胱癌組織和細胞中均高表達,這提示miR-483-5p在膀胱癌中扮演著癌基因的角色。為了探討miR-483-5p在膀胱癌中的診斷價值和預后意義,我們對miR-483-5p在膀胱癌診斷中的AUC及其表達與膀胱癌患者5年生存率的關系進行了研究。本研究結果表明,miR-483-5p在預測膀胱癌結局方面具有一定的準確性。此外,我們發(fā)現(xiàn)miR-483-5p表達水平的升高提示膀胱癌預后不良。這些發(fā)現(xiàn)表明miR-483-5p可能成為膀胱癌診斷和預后的重要標志物。我們還進行了體外實驗來探究miR-483-5p的生物學功能,結果表明,當miR-483-5p的表達受到抑制時,膀胱癌細胞EJ和T24的增殖、遷移和侵襲顯著受到抑制。這表明miR-483-5p在膀胱癌的發(fā)展中具有促進作用,并且可能成為腫瘤治療靶點。

研究發(fā)現(xiàn)PTGIS在膀胱癌組織中顯著下調,PTGIS過表達可以抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移[21]。本研究證實miR-483-5p可以直接靶向PTGIS,并且調節(jié)PTGIS mRNA和蛋白的水平。基于這些結果,可以推測miR-483-5p可能通過直接抑制PTGIS的表達在膀胱癌中發(fā)揮致癌作用。

綜上所述,miR-483-5p在膀胱癌組織和細胞中的表達上調,抑制miR-483-5p可以抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲,miR-483-5p可以負向調節(jié)PTGIS。這些發(fā)現(xiàn)為膀胱癌的診斷和治療提供了新的治療靶點和治療策略。