SMAD7、SMAD9與肺腺癌患者預(yù)后及免疫浸潤的相關(guān)性分析

李曉武, 張有為, 馮 玉, 韓 亮, 袁 媛

(徐州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科, 江蘇 徐州 221000)

肺腺癌屬于非小細(xì)胞肺癌,肺腺癌的發(fā)病率約占所有肺癌病例的40%,是最具侵襲性的腫瘤類型之一,預(yù)后差,患者總生存期不到5年[1]。肺癌組織中的腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、多種基質(zhì)細(xì)胞共同組成免疫抑制微環(huán)境,腫瘤免疫抑制微環(huán)境會直接影響患者預(yù)后[2]。據(jù)報(bào)道,腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后有關(guān),可通過分析免疫細(xì)胞浸潤的模式對預(yù)后進(jìn)行預(yù)測[3]。SMAD蛋白是一種胞內(nèi)信號分子,可對轉(zhuǎn)化生長因子-β信號傳導(dǎo)進(jìn)行調(diào)節(jié),轉(zhuǎn)化生長因子-β在細(xì)胞發(fā)育和致癌過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β可以促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞株增值[5]。目前已發(fā)現(xiàn)至少9種SMAD蛋白[6]。按照抑制或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β家族的信號傳導(dǎo)分為體激活型、共同型和抑制型3類,其中SMAD7、SMAD9的研究較少[7-8]。基于此,本研究旨在探討SMAD7、SMAD9在肺腺癌預(yù)后中的價(jià)值及其與免疫浸潤的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑TakaraRNA提取試劑盒(9767)、Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒(D6110A)、Takara TB Green?Fast qPCR Mix(RR430S)。

1.2 差異基因篩選GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)用于預(yù)測SMAD家族9個家族成員在肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)中的表達(dá)水平,GEPIA數(shù)據(jù)庫中的信息來自于TCGA和GTEx,其中包含483份LUAD組織的信息以及347份配對癌旁正常組織的信息。此外借助GEPIA數(shù)據(jù)庫預(yù)測SMAD7、SMAD9表達(dá)水平對肺腺癌患者生存的影響。

1.3 免疫浸潤相關(guān)性分析TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)用于預(yù)測SMAD家族中差異表達(dá)明顯的成員與免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)浸潤水平的相關(guān)性。GEPIA數(shù)據(jù)庫用于分析SMAD家族中差異表達(dá)明顯的成員與免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性。

1.4 受試者資料收集2016年4月至2017年4月在徐州市中心醫(yī)院納入108例行手術(shù)治療的肺腺癌患者標(biāo)本,手術(shù)切除癌組織與癌旁組織并立即在液氮中冷凍保存。其中男性患者63例,女性患者45例,平均年齡(52.11±9.36)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):病理學(xué)確診為肺腺癌,未接受過放療或化療等其他輔助性治療,臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):病理學(xué)診斷為其他類型肺癌患者,合并其他腫瘤患者,具有手術(shù)禁忌證無法進(jìn)行手術(shù)治療患者,臨床資料不全及失訪患者。所有患者及其家屬對研究內(nèi)容知曉并簽署書面知情同意書,本研究經(jīng)過徐州市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(審批號:XZXY-LJ-20200110-091)。

1.5 qRT-PCR檢測SMAD7和SMAD9的mRNA表達(dá)取待測組織,使用RNA提取試劑盒提取待測組織的總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,而后使用TB Green?Fast qPCR Mix(RR4305)進(jìn)行real-time PCR檢測。具體實(shí)驗(yàn)步驟見以上試劑盒的說明書。SMAD7引物序列:正向5′-ACAA-CCGCAGCAGTTACCC-3′,反向5′-TCGAAAGCCTTGATGGA-3′, SMAD9引物序列:正向5′-CT-ACCGTCTGCAAGATCCCC-3′,反向5′-AGCACCCCAACCCTTAACAAA-3′,GAPDH內(nèi)參引物序列:正向5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,反向5′- GGCATGGACTGTGGTACATGAG-3′。 用2-△△Ct法計(jì)算SMAD7、SMAD9相對表達(dá)水平。

1.6 預(yù)后分析根據(jù)SMAD7和SMAD9表達(dá)的平均數(shù)將患者分為SMAD、SMAD9高表達(dá)組和低表達(dá)組,對比患者生存時(shí)間。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響患者生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)測因素,5年隨訪結(jié)束,死亡患者為陽性事件記作“1”,生存患者記作“0”。HR為風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)值比值,當(dāng)HR>1時(shí),提示暴露因素是陽性事件的促進(jìn)因素,HR<1時(shí),提示暴露因素的陽性事件的阻礙因素,HR=1時(shí),提示暴露因素對陽性事件無顯著影響。

2 結(jié)果

2.1 SMAD家族成員在肺腺癌組織中的差異表達(dá)水平比較GEPIA數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示,相對于正常組織樣本,SMAD7、SMAD9在癌組織樣本中的表達(dá)降低(P均<0.05),見圖1。

注: A, SMAD7在正常組織與癌組織樣本中的表達(dá); B, SMAD9在正常組織與癌組織樣本中的表達(dá)。圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫預(yù)測SMAD家族成員在正常組織與肺腺癌組織樣本中差異表達(dá)圖

2.2 SMAD7、SMAD9的表達(dá)水平與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系分析結(jié)果GEPIA數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示SMAD7、SMAD9低表達(dá)水平的患者總生存率低于SMAD7、SMAD9高表達(dá)水平的患者(P均<0.05),見圖2。

注: A, SMAD7表達(dá)水平對肺腺癌患者生存的影響; B, SMAD9表達(dá)水平對肺腺癌患者生存的影響。圖2 GEPIA數(shù)據(jù)庫預(yù)測SMAD7、SMAD9表達(dá)水平對肺腺癌患者生存的影響圖

2.3 SMAD7、SMAD9與免疫細(xì)胞浸潤水平的關(guān)系分析結(jié)果TIMER網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示,SMAD7與B細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞水平均呈正相關(guān)(P均<0.05),與CD8+T 細(xì)胞的水平無相關(guān)性,SMAD9與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞水平呈正相關(guān)(P均<0.05),與CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的水平無相關(guān)性。見圖3。

2.4 SMAD7、SMAD9與免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性分析結(jié)果GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示SMAD7與CD115、CD86、CD68、CCL2、IRF5呈正相關(guān)(P均<0.05),SMAD9與CCL2、IRF5呈正相關(guān)(P均<0.05)。見表1。

表1 SMAD7、SMAD9與免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性預(yù)測結(jié)果

2.5 SMAD7、SMAD9在肺腺癌患者癌組織中的表達(dá)檢測及其預(yù)后分析結(jié)果qRT-PCR檢測肺腺癌患者癌旁組織與癌組織中SMAD7、SMAD9的表達(dá)水平顯示,相對于癌旁組織中SMAD7(1.00±0.27)、SMAD9(1.00±0.31)的表達(dá),癌組織中SMAD7(0.76±0.24)、SMAD9(0.81±0.22)的表達(dá)降低(P均<0.05),見圖4A。以平均數(shù)(SMAD7:0.79,SMAD9:0.85)作為界限,分為SMAD7高表達(dá)水平患者(54例)與低表達(dá)水平患者(54例),SMAD9高表達(dá)水平患者(55例)與低表達(dá)水平患者(53例)。SMAD7高表達(dá)水平患者和低表達(dá)水平患者、SMAD9高表達(dá)水平患者和低表達(dá)水平患者的一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),見表2。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示,SMAD7、SMAD9低表達(dá)患者的5年總生存率低于高表達(dá)患者(P均<0.05),見圖4B、 4C。

表2 SMAD7、SMAD9表達(dá)與患者一般資料的關(guān)系

注: A, qRT-PCR檢測SMAD7與SMAD9在癌旁組織與癌組織中相對表達(dá)水平; B, SMAD7表達(dá)水平對肺腺癌患者生存的影響; C, SMAD9表達(dá)水平對肺腺癌患者生存的影響。***P<0.001。圖4 qRT-PCR檢測及生存分析圖

2.6 影響肺腺癌患者生存時(shí)間的多因素分析結(jié)果Cox分析結(jié)果顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T3+T4分期、組織學(xué) Ⅲ 級與SMAD7、SMAD9水平是影響肺腺癌患者總生存時(shí)間的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(P均<0.05)。見表3。

表3 影響肺腺癌患者生存時(shí)間的Cox多因素分析結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)果顯示SMAD7、SMAD9低表達(dá)水平的肺腺癌患者總生存率低于高表達(dá)水平肺腺癌患者,與GEPIA數(shù)據(jù)庫預(yù)測預(yù)測具有一致性。一方面原因可能是:SMAD家族是轉(zhuǎn)化生長因子-β信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子,參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、合成、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[9];LASP1調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β/SMAD信號通路,影響SMAD7蛋白水平,誘導(dǎo)肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10];上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制之一,轉(zhuǎn)化生長因子-β1可促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,SMAD7轉(zhuǎn)染則能抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。另一方面原因可能是:競爭性內(nèi)源RNA機(jī)制作用,如miR-21-5p通過降低SMAD7的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12];SMAD9是骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路中的一種新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,骨形態(tài)發(fā)生蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子-β家族的一種,SMAD9的表達(dá)通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號的激活而增加,可降低骨形態(tài)發(fā)生蛋白的活性[13]。陳東姣等[14]研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌腫瘤組織的SMAD9基因的mRNA表達(dá)顯著低于癌旁正常組織,并且肺腺癌患者中SMAD9基因低表達(dá)患者生存時(shí)間顯著低于高表達(dá)患者的生存時(shí)間。與本研究的結(jié)果一致。

免疫細(xì)胞浸潤與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展存在關(guān)聯(lián)[15]。本研究結(jié)果表明,SMAD7與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的水平呈正相關(guān),而與CD8+T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的水平無相關(guān)性;SMAD9與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的水平呈正相關(guān),但與CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的水平無相關(guān)性。提示,SMAD7和SMAD9在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中的特定細(xì)胞類型中起著不同的作用。例如,SMAD7和SMAD9與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞水平呈正相關(guān),推測SMAD7和SMAD9在這些細(xì)胞中參與了正調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)。與CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞水平無相關(guān)性,表明SMAD7和SMAD9對這些細(xì)胞可能沒有直接的調(diào)節(jié)功能。

本研究顯示SMAD7與免疫細(xì)胞標(biāo)志物CD115、CD86、CD68、CCL2、IRF5呈正相關(guān),SMAD7僅與CCL2、IRF5呈正相關(guān)。IRF5對腫瘤的發(fā)生起抑制作用[16],激活的樹突狀細(xì)胞及M1 型巨噬細(xì)胞均與肺腺癌患者較差的預(yù)后相關(guān)[17]。提示,檢測SMAD7、SMAD9在癌組織中的表達(dá)量對于預(yù)后免疫浸潤有一定的價(jià)值。有研究報(bào)道,腫瘤微環(huán)境中的多項(xiàng)因素可促使惡性腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[18]。本研究Cox分析結(jié)果顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T3+T4分期、組織學(xué)Ⅲ級與SMAD7、SMAD9水平是影響肺腺癌患者總生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)測因子,提示SMAD7、SMAD9有望成為肺腺癌預(yù)后評價(jià)的生物標(biāo)志物。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中的SMAD7和SMAD9表達(dá)水平降低,并且與免疫浸潤水平以及免疫細(xì)胞標(biāo)志物相關(guān)。本研究還存在一些局限性和不足之處。首先,本研究的樣本量相對較小,可能存在潛在的選擇性偏倚;其次,本研究主要關(guān)注SMAD7和SMAD9的表達(dá)水平與肺腺癌預(yù)后的相關(guān)性,但并未深入研究其具體的分子機(jī)制。今后將可擴(kuò)大樣本量并開展相關(guān)分子機(jī)制研究以驗(yàn)證本研究結(jié)論的可靠性。