PPARα基因敲除誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積的作用研究

秦可欣, 陳小翠, 崔元峰, 阿比旦·阿卜杜如蘇力, 托羅娜依·米吉提, 陳邦黨,

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 2第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院, 烏魯木齊 830000)

非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和過量脂質(zhì)蓄積為主要臨床病理學(xué)特征的慢性肝病,累及全球25%的人口[1]。1999-2018年間我國NAFLD發(fā)病率由18%增加到29%,呈逐年上升且年輕化趨勢[2]。NAFLD患者肝臟脂肪酸氧化功能障礙,導(dǎo)致過度異位脂質(zhì)沉積和細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡改變[3],并產(chǎn)生胰島素抵抗、炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),促使NAFLD進(jìn)展為脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[4],已逐漸成為肝衰竭和肝移植的重要原因。

過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)是核受體超家族的成員,有三種異構(gòu)型(α、β/δ和γ亞型)。PPARα是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,除肝臟外,其在心臟、骨骼肌、棕色脂肪、腸道和腎臟等多種組織中均有表達(dá),參與誘導(dǎo)脂質(zhì)代謝途徑相關(guān)基因表達(dá),下調(diào)炎癥反應(yīng)有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)肝臟中PPARα基因表達(dá)與NASH嚴(yán)重程度、內(nèi)臟脂肪和胰島素抵抗呈負(fù)相關(guān),且NASH組織學(xué)的改善與其表達(dá)增加相關(guān)[6]。在肝臟特異性PPARα敲除小鼠中,高脂飲食誘導(dǎo)12周其肝臟炎癥相關(guān)指標(biāo)和血漿總膽固醇水平明顯增高[7]。然而,敲除腸道中PPARα可限制機(jī)體脂質(zhì)的吸收,并限制脂滴的擴(kuò)張,抑制肝臟組織中的脂質(zhì)沉積[8]。以上結(jié)果體現(xiàn)了PPARα在肝臟脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)和NAFLD進(jìn)展中的重要地位,但其作用機(jī)制較復(fù)雜,為了進(jìn)一步闡明PPARα在機(jī)體脂質(zhì)代謝中的作用,本研究利用全身性PPARα基因敲除小鼠模型,研究PPARα對肝臟脂質(zhì)蓄積的調(diào)節(jié)功能,并通過檢測肝組織中PPARα所調(diào)控的脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(CD36)、花生四烯酸ω羥化酶(Cyp4a14)以及脂滴包被蛋白2(Plin2)的蛋白表達(dá)情況,分析其可能的作用機(jī)制,為NAFLD等代謝性疾病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物遺傳背景為C57BL/6J的雄性野生型小鼠(WT組)和PPARα基因敲除小鼠(PPARα KO組),各8只,均購置于上海南方模式生物科技股份有限公司,許可證號碼:SCXK(滬)2017-0010。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF級屏障系統(tǒng)中,環(huán)境溫度控制在22～25℃,相對濕度達(dá)40%～70%,光暗周期12 h,空氣潔凈度達(dá)1萬級,自由飲水和進(jìn)食。嚴(yán)格遵守動物倫理和福利的要求進(jìn)行所有實驗操作,過程均符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司,貨號DP304-03)。總膽固醇(TC,日本和光純藥,貨號635-50981);甘油三酯(TG,日本和光純藥,貨號632-50991);0.5%油紅O(Sigma公司,批號O0625);HE染液(Biosharp公司,貨號BL700B);PPARα抗體(Cayman,貨號Cay101710-1);脂滴包被蛋白2(Plin2)抗體(Proteintech公司,貨號15294-1-AP);花生四烯酸ω羥化酶(Cyp4a14)抗體(Santa Cruz公司,貨號SC-271983);Hsp90(貨號ab13492)、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(CD36)抗體(貨號ab252922)、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠(貨號ab6789)以及羊抗兔抗體IgG(貨號ab6721)均購自Abcam公司。冰凍切片機(jī)、石蠟包埋和切片機(jī)(德國Leica公司);低溫冷凍高速離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司);冷凍研磨儀(浙江美壁儀器有限公司);凝膠成像分析儀ChemiDoc M、凝膠電泳儀以及PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司);瓊脂糖凝膠電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 PPARα基因敲除小鼠鑒定小鼠出生至2月齡后,剪取鼠尾約0.5 cm,放置入1.5 mL無菌EP管中,參照天根基因組DNA提取試劑盒操作方法,加入裂解液和蛋白酶K,55℃水浴過夜裂解,95℃變性后,12 000 r/min離心5 min,取上清為模板行PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR反應(yīng)體系(20 μL/管):2×Taq PCR MasterMix II 10 μL;引物P1、P2各0.5 μL;超純水7 μL;DNA模板2 μL。引物P1:CTGGTCTTAAGCTCACAATCCTC;引物P2: CTCTACATGGTCACCTCTGCTCTA。PCR循環(huán)條件為:95℃ 5 min;95℃ 15 s;58℃ 15 s;72℃ 1 min;72℃ 5 min;4℃保持,2～4步循環(huán)35次,擴(kuò)增結(jié)束的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定,并進(jìn)行雙向測序驗證。

1.4 血清及肝組織樣本收集小鼠飼養(yǎng)16周,兩組小鼠禁食不禁水12 h后稱重,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,心臟穿刺采血,血樣室溫放置1 h后,4℃冰箱放置2 h,4℃條件下以3 000 r/min離心10 min,收集血清樣本凍存。肝臟經(jīng)冰鹽水漂洗后大體形態(tài)拍照,稱量肝臟濕重,并將肝臟切成數(shù)個小塊,液氮快速冷凍后放置-80℃冰箱,部分肝組織制成石蠟切片和冰凍切片備用。肝臟指數(shù)的計算公式:肝臟濕重/小鼠空腹體重×100%。

1.5 肝臟組織病理學(xué)分析肝臟組織經(jīng)多聚甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋,5 μm厚切片。常規(guī)HE染色,在顯微鏡下觀察肝組織病理結(jié)構(gòu)變化。新鮮配置0.3%油紅O工作液,37℃加熱10 min,0.45 μm濾器過濾待用。從-80℃冰箱中取出包埋的肝臟組織,切成厚度為8 μm的冰凍切片,滴加油紅O染色孵育5 min,充分水洗,水溶性封片劑封片,顯微鏡下每個切片隨機(jī)選10個視野進(jìn)行拍照,觀察肝組織中脂質(zhì)蓄積情況。

1.6 肝臟及血清中TC和TG含量檢測取20 mg左右肝臟組織,加入1.2 mL甲醇/氯仿(1∶2體積)混合液勻漿,37℃300 r/min翻轉(zhuǎn)抽提3 h,2 000 r/min離心10 min,收集上清液,加入400 μL蒸餾水震蕩混勻,12 000 r/min離心10 min,收集有機(jī)溶劑層,取20 μL蒸干后加入等體積無水乙醇溶解脂質(zhì),根據(jù)試劑盒說明書測定肝臟及血清中甘油三酯和膽固醇的含量。

1.7 肝臟組織中PPARα、CD36、Cyp4a14和Plin2蛋白表達(dá)稱取20 mg肝組織,加入300 μL RIPA裂解工作液并組織勻漿,經(jīng)超聲破碎后提取WT和PPARα KO小鼠的肝組織總蛋白,用BCA蛋白定量分析試劑盒定量后行SDS-PAGE電泳,每孔上樣40 μg總蛋白。以80 V恒壓電泳30 min,待樣品跑過濃縮膠后,再以120 V恒壓電泳1 h,并以80 V恒壓3 h轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后,分別與PPARα、CD36、Cyp4a14和Plin2及Hsp90一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜,TBST洗膜5次,每次5 min,后用HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶1 000)室溫孵育2 h,同上洗膜,ECL發(fā)光液孵育后,取出PVDF膜于凝膠成像分析儀上進(jìn)行曝光分析,以Hsp90為內(nèi)參照,Image Lab對目的蛋白與Hsp90灰度的比值進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。

2 結(jié)果

2.1 PPARα基因敲除小鼠的構(gòu)建提取小鼠的鼠尾總DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,檢測結(jié)果顯示:擴(kuò)增出919 bp條帶的是WT小鼠,擴(kuò)增出559 bp條帶的是PPARα基因敲除小鼠(如圖1A),PCR產(chǎn)物經(jīng)雙向基因測序結(jié)果顯示,與WT小鼠相比,PPARα KO小鼠的基因在338 bp和697 bp之間發(fā)生了缺失突變。

注:A是PPARα KO小鼠PCR鑒定,B是PPARα KO小鼠蛋白表達(dá)鑒定。圖1 PPARα 基因敲除小鼠鑒定

提取小鼠肝臟組織總蛋白,Western Blot檢測結(jié)果顯示,在WT小鼠肝臟中檢測到PPARα蛋白表達(dá),而PPARα KO小鼠肝臟中未檢測到PPARα蛋白(圖1B),說明敲除PPARα基因的exon4后,導(dǎo)致PPARα蛋白讀碼框發(fā)生移碼,提前終止翻譯,正常的PPARα蛋白無法表達(dá),證明成功構(gòu)建獲得PPARα基因敲除小鼠。

2.2 兩組小鼠肝臟形態(tài)、體重、肝臟濕重和肝臟指數(shù)比較肝臟形態(tài)如圖2A所示,與WT小鼠相比,4月齡的PPARα KO小鼠肝臟體積明顯增大,整體呈土黃色,表面較油膩,邊緣圓頓。兩組小鼠體重相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(23.30±0.44) gvs(23.11±0.69)g,P>0.05,見圖2B]。與WT小鼠的肝臟濕重(0.79±0.02) g和肝臟指數(shù)(3.40±0.07)%相比,PPARα KO小鼠的肝臟濕重(1.04±0.03)g和肝臟指數(shù)(4.51±0.07)%均顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01),見圖2C、2D。

注:A是肝臟大體形態(tài);B,C,D分別是兩組小鼠體重、肝臟濕重及肝臟指數(shù)情況; n=8,與WT小鼠比較, *P<0.01。圖2 兩組小鼠肝臟形態(tài)、體重、肝臟濕重和肝臟指數(shù)比較

2.3 PPARα敲除小鼠肝臟組織病理學(xué)改變HE染色結(jié)果顯示,4月齡PPARα KO小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性腫脹,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,排列結(jié)構(gòu)無序,細(xì)胞內(nèi)存在明顯的脂滴空泡,而WT小鼠染色結(jié)果正常(圖3A)。油紅O染色結(jié)果顯示,PPARα基因敲除后胞漿間隙內(nèi)分布大小不等的脂滴,脂質(zhì)沉積程度明顯增加(圖3B),表明PPARα基因敲除會增加小鼠肝臟的脂質(zhì)蓄積。

2.4 PPARα敲除對小鼠肝臟及血清TG和TC水平的影響與WT小鼠[肝臟TG含量(17.45±1.70)mg/g,血清TG水平(70.46±3.56)mg/dL]相比,PPARα KO小鼠的肝臟TG含量(33.26±3.05)mg/g和血清TG水平(122.7±14.61)mg/dL均顯著增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01),見圖4A、4C。WT小鼠和PPARα KO小鼠肝臟TC含量[(4.41±0.21)mg/gvs(4.46±0.18)mg/g]、血清TC水平[(81.49±4.61) mg/dLvs(82.97±3.57)mg/dL]比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4B、4D。

注: A, B是肝臟組織中TG和TC含量; C, D是血清中TG和TC水平; n=8, 與WT小鼠比較, *P<0.01。圖4 兩組小鼠肝臟及血清中TG和TC水平比較

2.5 PPARα敲除對肝臟CD36、Cyp4a14及Plin2蛋白表達(dá)的影響Western Blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與WT小鼠比較,PPARα KO小鼠肝臟中PPARα所調(diào)控的靶蛋白CD36和Cyp4a14的表達(dá)均顯著降低,脂滴包被蛋白Plin2的表達(dá)顯著增高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1、圖5。

表1 兩組小鼠肝組織CD36、Cyp4a14和Plin2蛋白相對表達(dá)水平比較(n=6/組,

注:與WT小鼠比較, *P<0.01。圖5 兩組小鼠肝臟CD36、Cyp4a14及Plin2蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

隨著人們生活方式和營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的改變,非酒精性脂肪肝的患病率增高,已超過病毒性肝炎居慢性肝病之首,成為威脅國民健康的重大公共健康問題[9]。NAFLD的特征是肝臟中脂肪沉積過多伴部分組織損傷或炎癥,脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)失衡是造成肝組織脂肪變性的直接原因,導(dǎo)致過多的脂類物質(zhì)在肝內(nèi)沉積,形成NAFLD。目前,NAFLD確切的發(fā)病機(jī)制仍不明確。根據(jù)“二次打擊”學(xué)說,肝臟脂肪的積累是第一次打擊,使肝臟脂質(zhì)代謝紊亂,脂質(zhì)過量沉積的肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化(第二次打擊)從而導(dǎo)致肝臟損傷、炎癥壞死和纖維化。因此,探尋抑制肝臟脂質(zhì)積累的潛在干預(yù)治療靶標(biāo)對防控NAFLD具有重要意義。

代謝性核受體PPARα作為脂肪酸感受器和調(diào)節(jié)脂代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,與視黃醛X受體形成異二聚體復(fù)合物,移位到細(xì)胞核,與過氧化物酶體增殖物激活受體反應(yīng)元件結(jié)合而促進(jìn)其下游基因的轉(zhuǎn)錄,活化調(diào)控眾多涉及脂質(zhì)合成與氧化、葡萄糖攝取、炎癥及免疫相關(guān)基因的表達(dá)[10]。PPARα主要通過激活氧化磷酸化和脂肪酸β氧化相關(guān)通路來降低肝臟脂質(zhì)水平,此外,還參與調(diào)控多條通路,如過氧化體相關(guān)的氧化脂肪酸、乙酰輔酶A羧化酶、核受體基因等發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和能量代謝的功能[11]。既往研究表明肝細(xì)胞特異性的PPARα缺失可誘導(dǎo)衰老小鼠(51周)自發(fā)性的肝臟脂肪變性[12],高脂飲食會誘發(fā)全身性及肝臟特異性PPARα基因敲除的小鼠發(fā)生嚴(yán)重的脂肪肝[13]。PPARα基因敲除小鼠肝臟中游離脂肪酸含量明顯增多,脂質(zhì)代謝明顯紊亂[14]。本研究結(jié)果顯示,PPARα基因敲除后導(dǎo)致小鼠肝臟內(nèi)脂肪沉積增多出現(xiàn)明顯的脂肪變,同時顯著升高血清TG濃度,提示4月齡PPARα基因敲除小鼠在普食喂養(yǎng)條件下可自發(fā)出現(xiàn)明顯的肝臟脂肪變性和高甘油三酯血癥表型,表明PPARα對維持肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要,PPARα參與了肝臟脂肪代謝。因此PPARα可能成為防治NAFLD的潛在藥物干預(yù)靶標(biāo)[15-16]。

研究表明PPARα激活劑活化PPARα后可通過誘導(dǎo)下游脂肪酸轉(zhuǎn)運體CD36以及脂肪酸氧化酶Cyp4a14等靶基因高水平轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)脂肪酸在過氧化物酶體和線粒體中的分解和氧化[17]。PPARα可通過增加Cyp4a的表達(dá),催化不飽和脂肪酸在ω和ω1位點羥基化,加速脂肪酸氧化。在本研究中,PPARα基因敲除小鼠肝臟CD36和Cyp4a14蛋白表達(dá)顯著降低,而脂滴包被蛋白Plin2表達(dá)水平顯著增高,推測可能由于敲除了PPARα,CD36的表達(dá)降低,肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜的二次轉(zhuǎn)運受抑制,從而過多的脂肪酸聚集在胞內(nèi)[18],同時Cyp4a14的表達(dá)也降低,抑制了脂肪酸的氧化,而脂滴包被蛋白Plin2的表達(dá)增高促進(jìn)了脂滴吸收和脂質(zhì)堆積。

綜上所述,本研究通過普通飲食喂養(yǎng)WT和PPARα KO小鼠,發(fā)現(xiàn)4月齡PPARα KO小鼠會出現(xiàn)肝臟腫大、肝臟脂質(zhì)堆積和高甘油三酯血癥等NAFLD的表型,為以PPARα為靶點治療非酒精性脂肪肝等代謝性疾病的治療藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。