IL-33在哮喘合并間歇性缺氧發病過程中的作用

張 艷, 姚巧玲, 宋海辰, 于文燕, 孫 湛, 馬小娟

(1新疆醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室, 2新疆地方病分子生物學重點實驗室,3新疆醫科大學基礎醫學院生理學教研室, 烏魯木齊 830017; 4新疆醫科大學第一附屬醫院兒內一科, 烏魯木齊 830054)

哮喘(Asthma)是一種以可逆性氣流受限、氣道高反應性和氣道炎癥為特征的異質性疾病。阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(Obstructive sleep apnea syndrome,OSAS)以間歇性缺氧為標志,上呼吸道完全阻塞(呼吸暫停)或部分阻塞(低通氣)反復發作是其主要特征。OSAS與心血管疾病、胰島素抵抗、神經損傷和死亡率增加有關[1]。哮喘和OSAS有相似的合并癥和潛在的病理生理學重疊。

白介素-33(Interleukin-33,IL-33)屬于白介素-1(Interleukin-1,IL-1)家族成員,是最新發現的一種與炎性疾病相關的促炎細胞因子,在調節機體血管生成以及炎癥發生過程中具有重要作用[2]。Cayrol等[3]研究發現,IL-33與哮喘的關系密切,能夠參與調節多種與哮喘相關的細胞及細胞因子。Sozer等[4]研究發現OSAS組患者血漿IL-33表達明顯高于對照組。Perez等[5]指出IL-33可以作為一種前炎性細胞因子,活化炎癥細胞產生多種炎癥因子。故IL-33作為警報蛋白間接增加IL-1、IL-6、C反應蛋白等炎癥因子的表達,促進了慢性炎癥性疾病的發展。因此認為,慢性炎癥狀態會增加組織 IL-33 的含量,而 IL-33 可能與持續的炎癥信號協同作用,從而進一步促進炎癥和組織損傷。此外,有報道表明IL-33作為促進血管生成的因子,可促進皮膚肥大細胞和人角質形成細胞系HaCaT產生血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)[6],而VEGF在血管生成過程中發揮著不可替代的作用,尤其是對于胚胎發育、傷口愈合和腫瘤生長過程中的新生血管生成[7]。

目前關于哮喘合并OSAS相互關聯的機制研究較少,且關于二者之間發病機制以及病理生理過程存在一定的爭議。本研究用C57BL/6J小鼠建立哮喘合并間歇性缺氧模型,通過研究小鼠肺組織IL-33、VEGF以及代表性炎癥因子(IL-6、TNF-α)等指標的變化,探討IL-33在哮喘合并間歇性缺氧發病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物選取健康雌性C57BL/6J小鼠32只,6～8周齡,體重18～20 g。以隨機數字表法將小鼠分為對照組(NS-RA組)、間歇性缺氧組(NS-IH組)、哮喘組(OVA-RA組)和哮喘合并間歇性缺氧組(OVA-IH組),每組各8只。小鼠由湖南省斯萊克景達有限公司提供,許可證號:SCXK(湘)2019-0004,本研究嚴格按照國際實驗動物護理評估與認證協會指南中的建議進行。

1.2 研究方法

1.2.1 造模 (1)哮喘模型建立:將OVA-RA組和OVA-IH組小鼠分別于第1天和第15天腹腔注射0.2 mL/只致敏液,致敏液由0.1mg卵清蛋白(OVA)+1 mg氫氧化鋁配制而成;第22天霧化吸入1% OVA溶液,每次30 min,每周3次,連續8周。(2)間歇性缺氧模型建立:在第28天將NS-IH組和OVA-IH組小鼠暴露于間歇性缺氧(intermittent hypoxia,IH)環境下。暴露于IH是通過氣體控制輸送系統進行的[8],在IH控制艙內每分鐘氧濃度在7%～21%呈正弦函數波動,每日暴露12 h(9∶00～21∶00),連續4周。(3)NS-RA組小鼠以生理鹽水代替OVA處理,在相同的艙內以常氧(Room air,RA)條件代替間歇性缺氧處理。

1.2.2 Quantitative Real-time PCR檢測IL-33和VEGF mRNA的表達 采用經典的Trizol法提取小鼠肺臟組織的總RNA,所用試劑及耗材均為RNase-Free型。IL-33引物序列: 上游引物, 5′-AATGCTTCACGGTGGAATAG-3′;下游引物,5′-GAAAGAAAGCTGAGGGAGTAG-3′。VEGF引物序列:上游引物,5′-TGTACCTCCACCATGCCAAGT-3′;下游引物,5′-CGCTGGTAGACGTCCATGAA-3′。β-actin引物序列:上游引物,5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′;下游引物,5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′。反應條件:94℃ 30 s;94℃ 5 s,60℃ 30 s,共40個循環。按照制造商的說明書,使用TransScript?one-Step Gdna Removal and CDNA Synthesis SuperMIX試劑盒(AT311-03;TRAN全式金,中國北京)進行逆轉錄反應。使用PerfectStartTMGreen QPCR SuperMIX試劑盒(AQ601-02;TRAN全式金,中國北京)在實時熒光定量PCR反應系統(Life Technologies,USA)中進行實時熒光定量分析,反應結束后分析熔解曲線,并將數據歸一化處理,采用2-ΔΔCt對基因表達水平進行定量分析。

1.2.3 Western Blot檢測IL-33和VEGF蛋白的表達 取40 mg肺組織,加入蛋白裂解液(Thermo,USA)后用研磨器研磨,冰上裂解離心并吸取上清。然后用BCA法進行蛋白定量。隨后通過12%SDS-PAGE凝膠分離40 μg蛋白樣品并轉移至PVDF膜,室溫下用5%BSA封閉2 h,然后在4℃下分別與IL-33(1∶3 000,兔抗,Affinity)、VEGF(1∶1 000,兔抗,proteintech)、β-actin(1∶2 000,兔抗,proteintech)一抗孵育過夜。接下來,用相應二抗(1∶5 000,HRP偶聯山羊抗兔IgG;proteintech,USA)在室溫條件下孵育1 h,并使用增強的化學發光試劑盒(biosharp,中國)進行顯影。采用Image J進行統計分析。

1.2.4 酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測肺組織IL-33、IL-6以及TNF-α的變化 將肺組織于冰上充分研磨后,以5 000 g離心10 min后取上清液進行檢測。使用ELISA試劑盒檢測肺組織中IL-33、IL-6以及TNF-α的濃度。

1.2.5 肺組織病理學分析 將小鼠肺臟上葉浸入10%福爾馬林固定12 h,修整組織塊,常規石蠟包埋切片,進行蘇木素-伊紅(HE)染色。將石蠟切片常規脫蠟至水,并按照試劑盒說明書中的方法進行Masson染色,普通光學顯微鏡來捕獲圖像,并采用Image定量分析染色結果。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織IL-33和VEGF mRNA表達變化與NS-RA組相比,其余3組小鼠肺組織中IL-33與VEGF mRNA表達均增加,其中OVA-IH組增加最顯著,差異有統計學意義(P<0.001),見表1、圖1。

注:A,IL-33 mRNA相對表達量;B,VEGF mRNA相對表達量;與NS-RA組相比, ###P<0.001。圖1 各組小鼠肺組織中IL-33和VEGF mRNA的表達

表1 各組小鼠肺組織中IL-33和VEGF mRNA的表達

2.2 各組小鼠肺組織中IL-33和VEGF蛋白表達變化與NS-RA組相比,OVA-IH組小鼠肺組織中IL-33與VEGF的表達明顯增加(P<0.01～0.05);與NS-IH組和OVA-RA組相比,OVA-IH組小鼠肺組織中IL-33與VEGF的表達有所增加,但差異無統計學意義(P>0.05),見表2、圖2。

注: A, 各組蛋白免疫印跡圖; B-C, 各組蛋白相對表達水平; 與NS-RA組相比, #P<0.05, ##P<0.01。圖2 各組小鼠肺組織中IL-33和VEGF的蛋白表達

表2 各組小鼠肺組織中IL-33和VEGF蛋白的表達

2.3 各組小鼠肺組織中炎癥因子水平變化與NS-RA組相比,其余3組小鼠肺組織中IL-33和IL-6水平升高,其中OVA-IH組升高最明顯,差異有統計學意義(P<0.01～0.05);與NS-RA組相比,OVA-IH組小鼠肺組織中TNF-α水平升高,但差異無統計學意義(P>0.05);與NS-IH組相比,OVA-IH組小鼠肺組織中TNF-α水平升高且差異有統計學意義(P<0.05),見表3、圖3。

注: A-C, 各組小鼠肺組織炎癥因子水平; 與NS-RA組相比, #P<0.05, ##P<0.01; 與NS-IH組相比, *P<0.05。圖3 各組小鼠肺組織中炎癥因子的水平變化

表3 各組小鼠肺組織中IL-33、TNF-α和IL-6的水平變化

2.4 IL-33與TNF-α、IL-6水平的相關性Pearson相關性分析顯示,小鼠肺組織中IL-33和TNF-α(r=0.576 0,P<0.01)、IL-33和IL-6(r=0.765 3,P<0.000 1)均呈中度正相關,見圖4。

2.5 肺組織病理變化各組小鼠肺組織HE染色后鏡下觀察可見,NS-RA組肺組織支氣管結構光滑且完整,細胞排列整齊,管腔及其周圍未見明顯異常;其余3組小鼠氣道增厚,氣道上皮細胞水腫,杯狀細胞增殖,肺泡壁增厚,平滑肌增生,支氣管變形,支氣管壁結構受損,管腔內有脫落細胞,肺泡壁毛細血管充血和水腫增加,血管壁增厚,支氣管以及血管周圍有大量炎性細胞浸潤和蓄積(圖5A)。與NS-RA組相比,其余3組氣道黏膜中的膠原纖維表達增加,并有明顯的藍色膠原沉積(圖5B、圖6)。對Masson染色陽性區域進行定量分析并測量氣道膠原沉積指數發現,與NS-RA組(7.11±0.98)%相比,NS-IH組(14.13±1.59)%、OVA-RA組(18.31±1.49)%和OVA-IH組(19.73±1.28)%的氣道膠原沉積指數均升高,OVA-IH組升高最為明顯(P<0.001)。

注: 與NS-RA組相比, #P<0.05, ###P<0.001。圖6 各組小鼠肺組織Masson染色陽性面積比較

3 討論

近年來,越來越多的證據表明OSAS與肺部疾病(慢性阻塞性肺病、哮喘、間質性肺疾病和肺動脈高壓)之間存在雙向關系,即每種疾病都會對另一種疾病產生有害影響。相關研究報道顯示,哮喘合并OSAS的發病機制可能與神經機械反射性支氣管收縮、局部和全身炎癥、OSAS誘發的心功能不全對呼吸困難的間接影響、血管生成和瘦素相關氣道改變等病理生理過程有關[9]。采用卵清蛋白誘導激發建立哮喘小鼠模型以及間歇性缺氧建立間歇性缺氧小鼠模型已在許多研究中被廣泛應用[10-11]。本研究在此模型基礎上觀察哮喘合并間歇性缺氧小鼠肺組織中IL-33、VEGF以及炎癥因子白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達。

以往的研究發現,IL-33的mRNA表達于人和鼠的多種器官和細胞。在蛋白水平,IL-33主要表達在成纖維細胞、上皮細胞和內皮細胞[12]。本研究結果顯示,與對照組相比,各處理組小鼠肺組織中IL-33 mRNA和蛋白水平顯著增加。氣道炎癥是哮喘最常見的病理改變[13]。越來越多的研究也表明OSAS為低度慢性炎癥性疾病[14]。炎癥發生時炎癥因子表達增加,IL-33作為炎癥因子還參與肥大細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和自然殺傷細胞的活化[15]。有研究表明,哮喘[16]與OSAS[17]患者血清中IL-33均增加,這與本研究的結果一致。

炎癥發生時,抗炎與促炎的失衡導致機體分泌大量促炎和抗炎因子。IL-33的靶標包括參與Ⅰ型和Ⅱ型免疫和調節反應的免疫細胞,可參與Th2細胞的成熟,進而促進其他炎癥因子釋放增加[18]。本研究對炎癥因子IL-6和TNF-α的定量檢測發現,哮喘合并間歇性缺氧時IL-6和TNF-α的水平升高,提示間歇性缺氧可能使哮喘小鼠炎癥反應加重,而NS-IH組小鼠肺組織中TNF-α水平與NS-RA組相比略微降低,Corral等[19]也發現在阻塞性睡眠呼吸暫停患者牙齦溝液中的TNF-α水平顯著低于健康人群,推測可能是間歇性缺氧時,TNF-α作為炎癥介質具有抗炎和促炎雙重功能。相關性分析表明小鼠肺組織中IL-33和TNF-α、IL-33和IL-6均呈中度正相關,進一步提示IL-33可能與持續的炎癥信號協同作用,使炎癥反應放大進一步加劇組織損傷。

炎癥反應又與血管生成息息相關,VEGF在其中起著至關重要的作用。慢性炎癥可導致血管生成,血管生成是多種非腫瘤性慢性炎癥的重要組成部分[20]。在肺血管發育過程中的各種細胞因子中,VEGF是肺血管發育所需的最重要、最有效、最直接、最專一的生長因子,此外VEGF還可刺激血管內皮細胞的有絲分裂和血管的發生,提高單層內皮的通透性[21]。研究表明,在炎癥性腸病小鼠腸黏膜中VEGF顯著上調[22]。除了誘導炎癥反應外,IL-6和TNF-α也可能是生理和病理血管生成的重要調節分子,研究認為IL-6可能通過激活Janus激酶/信號傳導蛋白和轉錄激活物(JAK/STAT3)信號通路增加巨噬細胞中VEGF的表達[23],而TNF-α可能通過活性氧依賴性激活β-catenin從而上調RPE細胞中VEGF表達[24]。

本研究結果顯示,與對照組相比,各處理組小鼠肺組織中VEGF mRNA和蛋白水平明顯增加。在正常肺組織中,由肺泡上皮衍生的各類細胞均表達VEGF,尤其是肺泡Ⅱ型細胞以及細支氣管clara細胞、細支氣管周圍小動脈的平滑肌細胞[25]。氣道重塑是哮喘的關鍵特征,其中血管生成對于氣道重塑尤為重要[13]。間歇性缺氧是OSAS的主要特征,而氧供與氧耗失衡可引起血管生成[26]。VEGF是哮喘發病過程中的一個非常重要的分子生物學因素,支氣管哮喘患者痰液中VEGF的表達與哮喘嚴重程度和氣道炎癥密切相關[27]。OSAS可引起嚴重的低氧血癥及睡眠紊亂,低氧-復氧的交替過程可誘導機體缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)高表達從而導致VEGF 的表達增加[28]。本實驗通過形態學觀察也發現,OVA-IH組小鼠肺組織炎癥反應加重、氣道結構改變、氣道與周圍血管膠原沉積均增加。

綜上所述,本研究揭示了哮喘合并間歇性缺氧的發病過程中,IL-33與炎癥因子協同作用導致VEGF表達增加可能參與了其發病過程,這可能為臨床治療提供一個新的思路,但IL-33是否是介導哮喘合并間歇性缺氧疾病時血管生成相關氣道改變的關鍵因子還有待進一步的研究。