Atg2基因敲除對人骨肉瘤U2OS細胞增殖和遷移的影響

古麗妮尕爾·司馬義, 伊力亞斯·艾薩, 張金佩, 劉世玉, 席 慶, 米 娜

(1新疆醫科大學基礎醫學院生物化學教研室, 烏魯木齊 830017; 2新疆維吾爾醫學專科學校, 新疆 和田 848000;3新疆醫科大學基礎醫學院生物學教研室, 烏魯木齊 830017; 4新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院, 烏魯木齊 830054)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是兒童和青少年最常見的成骨干細胞癌,從原始間充質細胞發展惡化而來,以成熟骨樣基質沉積為典型特征[1]。在成骨過程中,間充質來源的成骨細胞具有極強的增殖和分化能力,涉及眾多信號通路和生理過程,其中任何一步發生異常都可使間充質來源的成骨細胞的增殖和分化失調進而惡化。骨肉瘤的主要治療方式為手術切除聯合術后輔助化療,復發率較高且預后不良[2-3]。目前,骨肉瘤的發生發展機制仍不明確,臨床上也缺乏相關標志物的檢測。因此,明確骨肉瘤的發生發展機制,尋找有效的分子靶點改善其預后具有重要的意義[4]。

細胞自噬(Autophagy)是真核細胞內的降解過程[5]。自噬調節異常與多種腫瘤的發生發展密切相關,自噬既能促進腫瘤存活,亦能促進腫瘤消亡[6]。這取決于腫瘤類型、疾病分期和腫瘤微環境等。自噬在不同類型的腫瘤細胞中、腫瘤發生的不同階段、腫瘤組織的不同部位都表現出不同的生物學活性與功能[7-8]。Atg2作為磷脂轉運蛋白[9],是自噬過程中的核心蛋白,在自噬體形成中起到了關鍵作用。Atg2有兩個同源物,即Atg2A和Atg2B[10]。越來越多的研究表明,自噬相關蛋白能影響細胞的遷移[11],細胞中的自噬障礙與腫瘤有關。自噬通過促進局部黏附和腫瘤代謝來加速轉移。自噬相關基因12(Atg12)和自噬相關基因6(Atg6)調節自噬蛋白1(AMBRA1)中的激活分子,通過自噬促進腫瘤的發生和發展[12]。自噬相關基因的敲除,可能會為腫瘤在臨床治療方面帶來新的研究方向。本研究以人骨肉瘤U2OS細胞為研究對象,通過觀察自噬相關基因2敲除后,骨肉瘤細胞的遷移和增殖情況,期望為臨床研究靶向治療人骨肉瘤提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑CO2細胞培養箱(美國,Thermo Fisher Scientific公司);KS18生物安全柜(美國,Thermo Fisher Scientific公司);C2plus激光共聚焦顯微鏡(日本,Nikon公司);垂直電泳儀、電泳槽及相關配套設備、濕轉膜儀(美國,Bio-Rad公司);U2OS穩定Atg2敲除細胞及基因未敲除空載體細胞(購自ATCC);高速低溫離心機(美國,Sigma公司);DMEM培養基(美國,Gibco公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國,Hyclon公司),青霉素-鏈霉素(美國,Hyclon公司,SV30010.01);胎牛血清(以色列,BI公司,04-002-1A);谷氨酰胺(美國,Thermo Fisher Scientific公司,25030081);二甲基亞砜(DMSO)(美國,Sigma-Aldrich公司,BCBZ1685);Goat Anti-Rabbit Ig(美國,Southern Biotech公司,4010-05);GAPDH(美國,Affinity affbiotech公司,AF7021);Atg2A(中國,proteintech公司,23226-1-AP);Atg2B(中國,proteintech公司,25144-1-AP)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與分組 復蘇細胞,利用腺病毒介導CRISPR/Cas9系統靶向剪切AAVS1位點,分為基因未敲除組(AAVS1細胞)和Atg2ab基因雙敲除組(Atg2abDKO細胞),配置含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素、1%谷氨酰胺的高糖完全培養基,并置于37℃,5%CO2培養箱中進行培養。當培養皿中細胞的匯合率達到95%時,細胞以1∶3～1∶4的比例進行傳代培養。

1.2.2 Western blot鑒定基因敲除的細胞 取對數生長期的AAVS1細胞和Atg2ab細胞,以3×103個/mL的密度均勻接種于六孔板,培養12～14 h后,PBS沖洗1次,加入十二烷基磺酸鈉蛋白裂解液,100℃變性15 min,在8%SDS-PAGE上進行電泳,濕轉法將蛋白轉至醋酸纖維素膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,PBS沖洗3次,室溫一抗以1∶1 000的比例孵育1 h,PBS沖洗3次后,二抗以1∶5 000的比例孵育1 h,PBS沖洗3次,采用電化學發光法(ECL)進行X-線片顯影。

1.2.3 CCK-8實驗 將兩種骨肉瘤細胞以5×103/孔接種于含有100 μL完全培養基的96孔板,在37℃、5%CO2培養箱中培養。分別培養24、48和72 h后,加入含CCK-8的DMEM10 μL,37℃、5%CO2培養箱中避光孵育30 min,使用酶標儀測量450 nm處的光密度值(OD值)。每組5個復孔,實驗重復3次,取平均值。

1.2.4 細胞平板克隆實驗 將兩組細胞分別接種于6孔板中(每孔100個細胞),再常規培養2周左右,4%的多聚甲醛固定細胞集落,0.1%結晶紫染色,顯微鏡下拍照觀察并計算細胞個數。

1.2.5 細胞劃痕實驗 將兩組細胞分別接種于6孔板內,每孔3 mL,待細胞生長至90%后,用200 μL的吸頭在每孔內垂直劃痕,PBS清洗掉落的細胞2～3次,分別加入含有3% FBS的劃痕培養基,培養24 h。實驗將0 h和24 h作為觀察點,于顯微鏡下拍照劃痕的寬度并做好記錄,計算劃痕面積,創面愈合率作為細胞遷移能力的依據。創面愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.2.6 Transwell遷移實驗 將對數生長的兩組細胞用無血清培養基饑餓24 h后消化細胞,終止消化后,離心棄去培養液,PBS清洗1遍,用含BSA的無血清培養基重懸,分別以每孔密度1×105,終體積200 μL接種于Transwell小室,下室加入600 μL含FBS培養基,常規培養24～48 h后用棉簽擦去上室內的細胞,用0.1%結晶紫染色,于200倍的顯微鏡下觀察實驗結果,每個小室隨機抽取3～6個視野拍照并計算穿過膜的細胞個數。

2 結果

2.1 Atg2基因敲除鑒定對U2OS細胞進行基因敲除鑒定,與AAVS1細胞比較,Atg2abDKO細胞中未見Atg2蛋白表達,提示Atg2基因敲除成功(圖1)。

2.2 Atg2敲除對U2OS細胞增殖能力的影響Atg2abDKO細胞在24、48及72 h的OD值均較對照組AAVS1細胞有所降低,但在72 h時,兩組細胞的OD值差異有統計學意義(P<0.01),見表1。

表1 Atg2基因敲除對U2OS細胞增殖能力的影響

2.3 Atg2基因敲除對U2OS細胞克隆形成能力的影響Atg2abDKO細胞形成的克隆數量少于對照組AAVS1細胞(6.33±2.31vs15.00±1.00),差異有統計學意義(P<0.01),見圖2。

注: A, AAVS1和Atg2ab DKO細胞平板克隆實驗結果; B, AAVS1與Atg2ab DKO細胞平板克隆實驗統計圖, 與AAVS1比較, **P<0.01。圖2 Atg2敲除對U2OS細胞克隆形成能力的影響

2.4 Atg2基因敲除對U2OS細胞遷移能力的影響劃痕實驗結果顯示,Atg2abDKO細胞創面愈合率(0.22±0.05)顯著低于對照組AAVS1細胞(0.82±0.05),差異有統計學意義(P<0.01),見圖3。

注: A, AAVS1和Atg2ab DKO細胞劃痕實驗結果; B, AAVS1與Atg2ab DKO細胞創面愈合率統計圖, 與AAVS1比較, **P<0.01。圖3 Atg2敲除對U2OS細胞遷移能力的影響(×200)

2.5 Atg2基因敲除對U2OS細胞穿過Transwell小室能力的影響與對照組AAVS1細胞相比,Atg2abDKO細胞穿過Transwell小室的細胞數量顯著減少(308.11±64.68vs79.78±48.95)(P<0.01)。說明Atg2基因敲除抑制U2OS細胞的遷移能力,見圖4。

3 討論

惡性腫瘤在發生、發展、轉移等諸多步驟中均與自噬有關,同時許多化療藥物可以誘發腫瘤細胞發生自噬,因此針對細胞自噬而采取相關干預策略有望成為一種新的腫瘤防治手段。

骨肉瘤是一種高度侵襲性的腫瘤,有向肺部擴散的趨勢,晚期發生轉移的骨肉瘤患者預后較差,分子靶向治療的提出有望為骨肉瘤患者減輕痛苦[13-14]。近年來,大量的研究表明,自噬與腫瘤的發生發展密切相關,許多調節自噬的藥物被用于臨床腫瘤治療的研究中。自噬在多種人類腫瘤中存在調控異常,在腫瘤細胞遷移和增殖、腫瘤干細胞維持和抗腫瘤治療中有著關鍵功能[15]。

腫瘤細胞的轉移涉及細胞的遷移、侵襲、上皮間充質化等,而細胞遷移對于腫瘤早期轉移至關重要,轉移是腫瘤相關性死亡的主要原因。自噬加速腫瘤細胞的轉移,因此預防和抑制腫瘤細胞轉移是治療骨肉瘤、延長患者生存時間和改善患者生存質量的關鍵。目前關于自噬在腫瘤進程中的作用認識相對貧乏,具體分子機制尚未明確,需要進一步深入研究。

本研究通過CCK-8實驗以及細胞克隆形成實驗結果,提示敲除Atg2基因后,細胞的增殖能力明顯減弱,表明Atg2對U2OS細胞的增殖起到了關鍵作用。細胞劃痕實驗及Transwell遷移實驗結果證實,Atg2的敲除可顯著抑制U2OS細胞的遷移能力。

綜上所述,本研究在人骨肉瘤細胞模型中明確了自噬相關基因Atg2在腫瘤細胞的遷移和增殖中發揮了重要作用。因此,進一步探究Atg2在細胞增殖和遷移中的作用,不僅將增強我們對腫瘤中自噬調節的理解,還有助于揭示此生物學功能的分子和生化機制。此外,Atg2與腫瘤細胞增殖和遷移的關系揭示了自噬相關基因可以影響細胞遷移的其他機制,這將為骨肉瘤新靶點的診療提供重要的實驗依據,對治療骨肉瘤產生重要的意義。