骨髓間充質干細胞移植治療大鼠蛛網膜下腔出血后鐵死亡的機制研究

田子玉, 楊宇航, 馬藝瑞, 劉俊杰,2, 王一超, 李建民,2

(華北理工大學1臨床醫學院, 2附屬醫院神經外科, 河北 唐山 063000)

蛛網膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是腦卒中的一種重癥亞型,病死率和致殘率極高,預后不佳[1]。相關研究證明[2],SAH后的早期腦損傷與患者預后差密切相關,在SAH早期腦損傷中,鐵死亡機制發揮重要作用,因此抗鐵死亡治療可作為SAH治療的新靶點。鐵死亡是一種鐵依賴性非凋亡性的新型細胞損傷方式,主要特征表現在鐵、脂質過氧化物含量的升高,谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量的降低[3]。此外,核轉錄E2相關因子2(Nuclear factor E2-related 2,Nrf2)/谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathioneperoxidase4,GPX4)信號通路是鐵死亡激活的關鍵途徑。Nrf2是推動GPX4基因轉錄[4-5]的重要因子,GPX4在調控鐵死亡的過程中起著關鍵作用[6],Nrf2、GPX4在神經細胞發生鐵死亡的過程中的表達水平及活性均降低,使細胞內脂質過氧化物的清除減少、聚集增多,從而加重了神經細胞的鐵死亡。骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植能起到良好的神經保護和促進損傷修復作用。目前關于BMSCs移植治療SAH后鐵死亡機制的報道較少,故本實驗基于Nrf2/GPX4通路觀察BMSCs對大鼠SAH后鐵死亡的治療作用,以期為SAH的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用Sprague-Dawley(SD)胚胎期3～5周齡雄性大鼠5只以及體重200～350 g的成年雌性大鼠100只,均購自北京維通利華實驗動物科技有限公司,許可證編號為SCXK(京)2020-0004。飼養于華北理工大學動物實驗中心,自由進食水,適應性喂養7 d。實驗方案獲得華北理工大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器Nrf2特異性抑制劑ML385(美國MedChemExpress公司,HY-100589);兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗GPX4多克隆抗體、普魯士藍染色試劑盒、組織鐵含量檢測試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量檢測試劑盒、GSH含量檢測試劑盒、GPX4活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:CLP0694、K003083P、G1428、BC4359、BC0021、BC1175、BC1194);鼠抗β-actin單克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司,貨號:sc-130345);IgG羊抗兔、IgG羊抗鼠單克隆抗體(美國KPL公司,貨號:71-00-16、71-00-15);ECL顯色試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司,貨號:C05-07004);OlympusBX53型光學顯微鏡(Olympus公司);Leica EG1150H型全自動石蠟包埋機、LeicaRM2235型切片機(LEICA公司)。

1.3 大鼠骨髓間充質干細胞原代分離與培養采用頸椎脫臼法處死3～5周齡SD雄性大鼠,分離大鼠的后肢脛骨和股骨,用1 mL注射器吸取添加了體積分數10%胎牛血清,1%青鏈霉素混合液的DMEM細胞培養基反復沖洗骨髓腔,1 000 r/min離心5 min后重懸于25 cm2培養瓶中,原代培養3 d后更換培養液,培養6～7 d后,細胞融合至80%～90%時用胰蛋白酶消化,按1∶3比例進行傳代培養。傳至第三代后,用流式細胞術鑒定細胞表型。

1.4 大鼠骨髓間充質干細胞的表型鑒定選擇生長良好的第三代BMSCs,PBS輕輕沖洗3次后用0.25%胰蛋白酶對其進行消化,當細胞與瓶壁脫離時即終止消化;4℃離心(1 000 r/min)10 min,棄去上清;細胞用PBS洗滌3次,4℃離心(1 000 r/min)10 min;分別滴加熒光標記抗體PE-CD31,FITC-CD34,PE-CD44,PE-CD105,在室溫下避光孵育30 min后,洗去多余抗體,加入200 μL PBS,用流式細胞儀進行檢測分析。

1.5 動物模型的制備及干預參照Bederson等[7]的文獻,通過血管穿刺法復制SAH大鼠模型。SD大鼠用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)通過腹腔注射進行麻醉,仰臥放置,在頸中央做切口,暴露出左側頸內、外動脈及頸總動脈,并在頸外動脈的近心端做一切口。將一根銳化4-0手術縫合線的頭端沿著頸外動脈的切口向頸內動脈方向輕輕逆行插入,在距離頸總動脈分叉18～19 mm處時有阻力感,需穿透動脈壁再送入5 mm深度,造成蛛網膜下腔出血。100只雌性SD大鼠中隨機取出25只作為假手術組(Sham組)(不刺破大腦前動脈與大腦中動脈分支,僅在感到穿刺線受阻時退出)。剩余75只大鼠進行造模,造模成功判定標準:剝離腦部時肉眼可以見到極其顯眼的血性液體散在分布在腦底基底池部位。75只大鼠均造模成功,隨機分為蛛網膜下腔出血組(SAH組)、蛛網膜下腔出血+BMSCs移植組(BMSCs組)和蛛網膜下腔出血+BMSCs移植+Nrf2特異性抑制劑ML385干預組(ML385組),每組25只。造模成功后3 h,ML385組大鼠經尾靜脈給予干細胞懸液2 mL,腹腔注射Nrf2特異性抑制劑ML385(30 mg/kg)[8];BMSCs組大鼠給予尾靜脈注射干細胞懸液2 mL;Sham組和SAH組大鼠尾靜脈注射對應等量生理鹽水。

1.6 早期腦損傷指標的檢測

1.6.1 神經功能學評分 參照Garcia等[9]的方法,對各組大鼠自主運動、四肢運動的對稱性、前肢的伸展運動能力、攀爬能力、觸須反應及四肢和軀體的本體感覺進行評價,得分越低,表明其神經系統功能損害越嚴重;得分越高,表明其神經系統功能損害程度越輕微。

1.6.2 腦組織含水量的測定 參照He等[10]的方法,麻醉后取出鼠腦,除去表面的血塊和腦膜,將其分別放在一個錫箔上(已知該錫箔重量是a),測得質量是b,b-a代表濕質量,隨后快速放置于烘箱24 h,直到衡重,稱得質量為c,c-a代表干質量。以腦組織含水量的計算公式為依據:腦組織含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%,可計算得出SAH后受損腦組織含水量。

1.7 標本處理頸椎脫臼法處死大鼠,取標本,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,使用一次性采血針穿刺左心室尖部,使用眼科剪將右心室剪開,打開靜脈竇,將300 mL冰生理鹽水快速灌注入心臟,至肝臟顏色發白,表明灌注良好,隨后立即去頭,取腦,多聚甲醛固定,用蔗糖脫水,OCT包埋,冰凍切片機冷凍切片,收集切片備用。

1.8 細胞鐵死亡指標的檢測鐵沉積情況用普魯士藍染色試劑進行檢測,分光光度計法檢測細胞鐵死亡相關指標:(1)鐵含量用組織鐵試劑盒進行檢測;(2)脂質過氧化物MDA的含量用脂質過氧化物試劑盒進行測定;(3)GSH的含量用GSH試劑盒檢測;(4)GPX4活性用GPX4試劑盒檢測,具體步驟參照廠家說明書。

1.9 Western blot法檢測Nrf2和GPX4蛋白表達水平配膠,上樣,電壓60V電泳,待上層膠與下層膠交界處分離,溴酚藍出現在其間時,將電壓調至120 V恒壓到底;切出合適面積的PVDF膜,切膠,將膜貼于膠上;轉膜后在室溫下用TBST配制的5%脫脂奶粉封閉2 h;孵育一抗、二抗;ECL顯影。

2 結果

2.1 大鼠骨髓間充質干細胞形態在原代培養3 d后可以看見BMSCs呈現放射狀分布,細胞形狀各不相同,培養6～7 d,在細胞融合度為80%～90%時消化傳代,到了第三代可以看見細胞呈旋渦式生長,且細胞形態呈長梭形,見圖1。

圖1 第三代大鼠BMSCs的形態特征

2.2 大鼠骨髓間充質干細胞表型鑒定結果流式細胞術檢測第三代大鼠骨髓間充質干細胞表面抗原CD31、CD34陽性率分別為0.7%和0.3%,呈陰性表達;CD44、CD105陽性率分別為100.0%和97.7%,呈陽性表達,見圖2。

圖2 大鼠BMSCs表面抗原流式細胞術檢測結果

2.3 四組大鼠神經功能學評分比較造模3 d后,四組大鼠神經功能學評分差異具有統計學意義(P<0.001)。SAH組[(12.22±1.40)分]大鼠神經功能學評分較Sham組[(17.41±0.59)分]顯著降低(P<0.05);BMSCs組[(15.57±1.59)分]大鼠神經功能學評分較SAH組顯著增高(P<0.05);ML385組[(13.18±1.49)分]大鼠神經功能學評分較BMSCs組降低(P<0.05)。

2.4 四組大鼠腦組織含水量比較造模3 d后,四組大鼠腦組織含水量差異具有統計學意義(P<0.001)。SAH組[(81.4±0.6)%]大鼠腦組織含水量明顯高于Sham組[(78.7±0.1)%]大鼠(P<0.05);BMSCs組[(79.2±0.1)%]大鼠腦組織含水量明顯低于SAH組大鼠(P<0.05);ML385組[(80.7±0.2)%]大鼠腦組織含水量明顯高于BMSCs組大鼠(P<0.05)。

2.5 BMSCs移植對SAH后鐵死亡的影響造模3 d后,四組大鼠鐵死亡相關指標差異具有統計學意義(P<0.001)。SAH組[(0.251±0.005)%]大鼠腦組織內鐵沉積情況較Sham組[(0.014±0.008)%]大鼠明顯加重,鐵含量、MDA含量顯著增多,GSH含量和GPX4活性顯著降低(P<0.05);BMSCs組[(0.181±0.003)%]大鼠腦組織內鐵沉積情況較SAH組明顯減輕,鐵含量、MDA含量明顯減少,GSH含量和GPX4活性顯著升高(P<0.05);與BMSCs組相比,ML385組[(0.231±0.006)%]大鼠腦組織內鐵沉積情況加重,鐵含量、MDA含量顯著增多,GSH含量和GPX4活性顯著降低(P<0.05),見圖3、表1。

表1 各組大鼠腦組織內鐵死亡相關指標的檢測

注:A,Sham組;B,SAH組;C,BMSCs組;D,ML385組。圖3 大鼠腦組織內鐵沉積情況(普魯士藍染色,標尺=20 μm)

2.6 BMSCs移植對Nrf2/GPX4信號通路的影響造模3 d后,Western blot結果顯示,各組大鼠腦組織中Nrf2和GPX4蛋白表達水平差異具有統計學意義(P<0.001)。與Sham組[(0.747±0.015),(0.945±0.17)]相比,SAH組[(0.389±0.014),(0.328±0.023)]大鼠腦組織中Nrf2、GPX4表達水平顯著減少(P<0.05);與SAH組相比,BMSCs組[(0.629±0.10),(0.826±0.017)]大鼠腦組織中Nrf2、 GPX4表達水平顯著增多(P<0.05);與BMSCs組相比, ML385組[(0.419±0.017), (0.520±0.023)]大鼠腦組織中Nrf2、GPX4表達水平顯著減少(P<0.05),見圖4、5。

注: A, Sham組; B, SAH組; C, BMSCs組; D, ML385組。圖4 各組大鼠受損腦組織中Nrf2和GPX4蛋白表達情況

注: 與Sham組相比, aP<0.05; 與SAH組相比, bP<0.05;與BMSCs組相比, cP<0.05。圖5 各組大鼠受損腦組織中Nrf2、GPX4蛋白相對表達量比較

3 討論

鐵死亡是一種鐵依賴性非凋亡性的細胞損傷方式,研究發現,SAH腦組織中存在鐵死亡,且與鐵代謝障礙[11]、線粒體功能障礙[12]和活性氧蓄積[13]等密切相關。因此,深入探索鐵死亡與SAH后早期腦損傷的潛在聯系,對SAH的診療具有十分重要的意義。

近年來隨著細胞免疫治療的發展,干細胞移植為有效治療腦血管疾病提供了新的方向和方法[14]。BMSCs不僅可以通過分化成神經元來修復卒中后的腦組織,還可以通過分泌多種神經營養因子,使神經細胞凋亡減少,誘導血管生成和神經發生等,進而減少梗死面積和減輕血腦屏障破壞[15]。本研究結果發現BMSCs移植治療后,神經功能學評分增高、腦組織含水量降低、鐵含量降低,說明BMSCs移植能顯著改善SAH大鼠腦組織的鐵死亡,提示BMSCs移植在SAH治療上是可行的。SAH后鐵死亡的大鼠腦組織內谷胱甘肽的合成受到影響進而造成GPX4的活性受到抑制,后者的活性降低同樣造成了細胞抗氧化能力下降,細胞內脂質活性氧生成和分解平衡紊亂,致使細胞膜脂質發生過氧化反應,最終導致細胞死亡[16-17]。本研究結果顯示,大鼠發生SAH后,腦組織內的MDA含量升高、GSH含量降低,BMSCs移植可提高SAH后大鼠腦組織內GSH、GPX4的表達水平,提升細胞抗氧化能力,減少細胞內活性氧的積累,減少細胞膜中的過氧化,進而發揮對鐵死亡的抑制作用。

Nrf2/GPX4信號通路在鐵死亡過程中發揮重要作用,其是細胞抗氧化系統的重要組成部分[14]。GPX4是內源性抗氧化系統中的谷胱甘肽系統調節的核心酶,GPX4還是鐵死亡的重要調控蛋白[6],當細胞內發生鐵死亡時,GPX4的表達和活性都會降低,進而造成脂質過氧化物的清除降低,加重鐵死亡[18]。Nrf2作為一種細胞內的轉錄因子,在多種疾病中對氧化應激損傷具有一定的保護作用[19],可增加GPX4的表達。本研究結果顯示,SAH大鼠在BMSCs移植后,受損腦組織中的Nrf2和GPX4表達水平增加,鐵含量明顯減少,提示BMSCs對SAH后鐵死亡的抑制作用與Nrf2/GPX4信號通路密切相關。本研究使用Nrf2/GPX4通路抑制劑后,大鼠腦組織中Nrf2、GPX4表達水平顯著減少,鐵含量顯著增多,說明Nrf2/GPX4信號通路參與SAH后受損腦組織的鐵死亡過程,BMSCs可通過調節此途徑對SAH后受損腦組織起保護作用。

綜上所述,本實驗結果表明BMSCs可以有效改善SAH后神經功能損傷,并且可以顯著減輕腦部水腫,減少鐵沉積,其機制可能與BMSCs調節Nrf2/GPX4信號通路進而抑制鐵死亡有關。本研究重點關注了BMSCs對Nrf2/GPX4信號通路的調節來抑制SAH后鐵死亡,進而起神經保護作用,由于SAH后鐵死亡發生的病理機制十分復雜,BMSCs是否還可以通過其他機制發揮作用,這值得后續研究進一步探討。