NFKB1 基因多態性與冠心病（心血瘀阻證）及炎癥因子的相關性研究*

陳 云 李 超

（浙江省金華市人民醫院，浙江金華 321000）

冠心病屬于中醫學“胸痹”“真心痛”“厥心痛”范疇，具有發病率高、致殘率高及致死率高［1］。流行病學研究證實，除了經典（如血脂異常、高血壓）的危險因素，遺傳因素參與冠心病發病機制得到了醫學界學者們的普遍認同［2］。心血瘀阻證是冠心病最為常見的證候類型［3］，國內多項研究表明心血瘀阻證與基因多態性相關［4-5］。近些年研究發現NFKB1-rs28362491基因多態性與中國西北地區人群冠心病易感性相關，純合突變DD基因型攜帶者冠心病發病風險增加［6］，但與冠心病（心血瘀阻證）研究尚缺乏全面的分析。本研究分析NFKB1 基因多態性與冠心病（心血瘀阻證）及炎癥因子的相關性，為中醫證候遺傳多態性提供一定的科學依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 診斷標準：冠心病診斷參照美國心臟病學會和心臟協會（ACC/AHA）冠心病心絞痛診斷指南和《2007 年中國慢性穩定性心絞痛診斷與治療指南》制定的穩定性心絞痛［7］。冠心病中醫辨證分型標準參照《中藥新藥治療胸痹的臨床研究指導原則》［8］《冠心病中醫辨證標準》［9］。本研究中所有受試者均為浙江中部地區漢族常住人群，相互之間均無血緣關系；年齡18～75 歲，性別不限，排除先天性心臟病、嚴重急慢性感染、肝腎功能不全、惡性腫瘤等疾病。受試患者均簽署知情同意書，所有相關操作經過醫院倫理委員會審核通過（倫理審批號：IBR-2021073-R）。

1.2 臨床資料 選取2018 年6 月至2021 年6 月就診于金華市人民醫院心血管內科疑似冠心病患者280例，根據冠脈造影結果，冠心病組173 例，根據中醫辨證分型，分為心血瘀阻證患者69 例，男性47 例，女性22例；年齡18～75歲，平均（62.69±4.13）歲；非心血瘀阻證患者104 例，男性69 例，女性35 例；年齡18～75 歲，平均（61.37±5.73）歲。107例非CHD 患者作為對照組，其中男性65 例，女性42 例，年齡18～75 歲，平均（61.78±5.35）歲。各組患者的臨床資料差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.3 治療方法 1）冠狀動脈造影術。采用Judkin 法造影，陽性診斷標準為至少有1 支主要冠脈或其主要分支血管內徑狹窄≥50%。由兩位經驗豐富的介入治療專家共同進行及判斷。2）NFKB1 基因多態性檢測。空腹抽取靜脈血5 mL，采用低滲法分離白細胞，提取DNA，利用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術（PCR-RFLP）擴增NFKB1 基因啟動區-94 位點，進行NFKB1 基因多態性檢測（I/D），具體方法參照文獻［10］。3）炎癥因子分析。抽取清晨空腹肘正中靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管收集，ALLEGRAX-15R 醫用低速離心機，1 000 r/min，離心15 min，血清于-80 ℃冰箱儲存。采用酶鏈免疫吸附法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）水平。

1.4 統計學處理 應用SPSS22.0 統計軟件。使用Hardy-Weinberg 平衡檢驗樣本的群體代表性。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料以“n、%”表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組NFKB1 基因rs28362491 位點多態性比較 見表1。NFKB1 基因rs2836249 位點的基因型及等位基因頻率在心血瘀阻證和非心血瘀阻證及對照組的分布均符合Hard-Weinberg 平衡定律（χ2=1.359、1.083、1.572，P＞0.05）。心血瘀阻證NFKB1 基因rs28362491位點DD 基因型頻率高于非心血瘀阻證和對照組，II、ID 基因型頻率低于非心血瘀阻證和對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。各組D、I 等位基因頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組基因型及等位基因分布比較［n（%）］

2.2 各組炎癥因子水平比較 見表2。各組患者TNF-α、IL-6、IL-8水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。心血瘀阻證TNF-α、IL-6、IL-8 水平均高于非心血瘀阻證和對照組（P＜0.05）。非心血瘀阻證與對照組TNF-α、IL-6、IL-8 水平比較，差異亦有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組TNF-α、IL-6、IL-8水平比較（ng/L，±s）

表2 各組TNF-α、IL-6、IL-8水平比較（ng/L，±s）

組 別心血瘀阻證非心血瘀阻證對照組n 69 104 107 TNF-α 27.83±2.19*△20.52±3.16*18.42±1.85 IL-6 30.57±1.92*△24.23±1.29*19.28±1.39 IL-8 25.72±1.59*△20.12±1.27*17.51±1.38

2.3 不同基因型患者炎癥因子水平比較 見表3。不同基因型組TNF-α、IL-6、IL-8 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。DD 基因型組TNF-α、IL-6、IL-8 水平均高于ID 和II 基因型組（P＜0.05）。ID 組和II 基因型組TNF-α、IL-6、IL-8 水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 不同基因型患者TNF-α、IL-6、IL-8水平比較（ng/L，±s）

表3 不同基因型患者TNF-α、IL-6、IL-8水平比較（ng/L，±s）

基因型DD ID II n 55 127 98 TNF-α 24.23±2.52*△18.23±4.28 17.97±2.72 IL-6 23.79±2.73*△18.38±1.57 19.53±2.42 IL-8 26.54±1.65*△19.23±1.83 21.78±2.42

3 討 論

冠心病屬中醫學“胸痹”“真心痛”“厥心痛”范疇，其發病與血瘀、痰濁、氣滯等有關，冠狀動脈痙攣中醫病機可用氣滯解釋，血液流速異常近似于中醫之血瘀證，冠狀動脈粥樣斑塊形成則與“痰濁”有關［11］。目前研究證實基因單核苷酸多態性與冠心病中醫證候有明顯的相關性，尤其在冠心病（心血瘀阻證）方面，包含血瘀證、血瘀阻滯證、瘀血痹阻證、瘀血閉阻證、瘀血阻脈證。宋曙霞等研究發現冠心病血瘀證患者ACE 基因多態性與血管病變嚴重程度相關，ACE 基因DD、I/D 型患者血管狹窄支數較Ⅱ型多［5］。徐長福等采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性檢測血瘀證組、非血瘀證及非冠心病MMP-3-1171 5A/6A 的基因型，發現MMP-3-1612 5A/6A 基因多態性與冠心病血瘀證發生相關，5A/5A基因型成為血瘀證易感性遺傳因素［12］。鄭景輝等研究證實IL-8-251A/T SNP AT 基因型可增加家族聚集性冠心病血瘀證的易感性［13］。

NFKB1 基因上游啟動子區域-94 位點存在基因多態 性（NFKB1-94-ins/del ATTG，rs28362491） 是NFKB1 基因中唯一具有表達功能的SNP，表現為ATTG 堿基的插入/缺失，編碼野生純合基因型（ins/ins，II），雜合突變基因型（ind/del，ID），純合突變基因型（del/del，DD）3 種基因。相關研究表明，在不同人群中，攜帶NFKB1 基因rs28362491 D 等位基因或DD 基因型的攜帶者易患冠心病［14］。辨證論治是中醫精髓，證候是疾病發生過程中不同階段病因病機的高度概括。一病可有多證，一證還見于多種疾病，“同病異治，異病同治”，不同證候類型間存在的基因多態性差異表達或許正是其物質基礎［15］。本研究結果提示冠心病（心血瘀阻證）NFKB1 基因多態性位點DD 基因型及D等位頻率明顯高于冠心病非心血瘀阻證及對照組，證實DD 基因型成為心血瘀阻的危險因素，但發病機制尚不明確。

炎癥因子參與動脈粥樣硬化斑塊、血栓形成進程，與冠心病的發生、發展密切相關［16］。TNF-α 破壞血管內皮細胞，誘發其他炎癥因子的合成及釋放，加速粥樣硬化斑塊形成［17］。此外，其促進冠心病患者的心肌收縮力下降及膜電位改變，導致惡性心律失常等心血管事件發生風險增加。IL-6 刺激心血管平滑肌分泌血小板源性生長因子，形成血栓，同時加快脂質在內皮細胞沉積速度，易患粥樣斑塊［18］。IL-8 引起血管細胞內鈣離子濃度超載，產生細胞變形反應、脫顆粒反應現象，影響活性氧產生效率，從而對冠心病患者的心肌細胞造成損傷［19］。由此可見，TNF-α、IL-6、IL-8 可能通過血管內皮細胞損傷、打破血凝-抗血凝平衡、加快脂質沉積等病理生理過程參與心血瘀阻證的形成。本研究結果表明，冠心病（心血瘀阻證）患者血清TNF-α、IL-6、IL-8 含量顯著高于冠心病非心血瘀阻證及對照組。進一步深入研究，NFKB1-rs28362491 基因DD 基因型TNF-α、IL-6、IL-8 水平高于II 基因型和ID 基因型。究其原因可能是等位基因D 調控NF-κB 的轉錄水平，抑制p50 蛋白合成，打破p50/p65 異源二聚體與p50/p50 同源二聚體在細胞內的平衡，進而影響其下游TNF-α、IL-6、IL-8的表達。

綜上所述，NFKB1-rs28362491 基因多態性與浙中地區漢族人群冠心病（心血瘀阻證）有關聯，DD 基因型可能干預TNF-α、IL-6、IL-8 水平成為冠心病（心血瘀阻證）易感性遺傳因素。基因-冠心病證候中西醫結合研究可作為中醫辨證的參考指標。由于本研究入組病例樣本量相對較少，且單中心患者，故今后需擴大樣本量及多中心開展深入研究，進一步揭示NFKB1-rs28362491 基因多態性-冠心病（心血瘀阻證）的相關性。