維甲酸結合蛋白CRABPs在腫瘤中的作用研究進展

林國粹 張穎 張慶余

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中的致死率最高者,其早期癥狀和體征難以檢測,缺乏有效的診斷標志物,導致大多數患者在首次診斷時已屬晚期。細胞內類維甲酸結合蛋白1(CRABP1)具有潛力激活類維甲酸信號,可能作為一種潛在的腫瘤抑制因子,與漿液性和透明細胞卵巢腺癌的不良預后密切相關。然而,CRABP2在多種腫瘤中的表達異常,其既可能促進腫瘤的發展,也可能抑制腫瘤的發展,CRABP2的致瘤機制相當復雜,相關研究仍處于初級階段。我們在本綜述中總結了CRABPs在腫瘤中的最新研究進展,探討CRABPs在各類腫瘤中的功能以及作用機制,以期為腫瘤診治提供新的生物標志物。

1 CRABPs概況

CRABPs家族成員包括CRABP1和CRABP2均是小分子(<15 kDa)蛋白質,含有8個反向β-折疊組成的β桶形結構蛋白質。CRABPs的三維結構中其羧基頭與口袋底部的2個精氨酸殘基和1個酪氨酸殘基相互作用。它們的序列同源性較低,折疊的相似性很高,是一種重復性很強的序列。在它們的序列中,同源性很低;而在它們的折疊中,相似性很高。它們的結構由一個螺旋-旋轉-螺旋基序和2個接近正交的五鏈β-折疊組成。它們共享1個高度保守的三維結構,在一個反平行的β-桶中結合特定的疏水配體,該β-桶由2個正交的五鏈β-薄片構成。在holo-CRABPs的三維結構中,維甲酸被埋在結合口袋中,其羧基頭基與口袋底部的2個精氨酸殘基和1個酪氨酸殘基相互作用。β-紫羅蘭酮環扭曲成順式相對于異戊二烯尾部的結構,作為口袋的入口,這樣只有一個邊可以接近溶劑,維甲酸被埋在結合口袋中,表明可能需要顯著的構象變化以使RA從結合口袋中釋放出來。人類CRABP1和2之間顯示了74%的序列一致性,而且在物種之間也極為保守,例如大鼠、小鼠和牛的CRABP1都是相同的。 CRABPs 在胚胎中廣泛表達,但它們通常不會共存于同一細胞中。這些差異表達譜,以及這兩種同型的高水平的物種間保護,表明盡管它們的 RA 結合親和力相似,但兩種 CRABP 在 RA 生物學中具有不同的功能[1]。

CRABP1全名細胞維甲酸結合蛋白1,別名CRABP,CRABP1,CRABPⅠ,RBP5,它位于15號染色體。CRABP1編碼維生素A家族成員的特異性結合蛋白,在介導RA對細胞分化和增殖過程中起著重要作用。CRABP1是蛋白質的脂肪酸結合家族的成員,它主要定位在細胞質中,并可以高親和力結合RA,CRABP1可以調節催化RA代謝轉化的酶的活性。對CRABP1參與人類癌癥病理的了解甚少,CRABP1可以調節催化維甲酸代謝轉化的酶的活性。成人中,CRABP1幾乎無所不在表達。

CRABP2全名細胞維甲酸結合蛋白2,別名CRABPⅡ,RBP6,它基因位于1號染色體。CRABP2僅在皮膚、子宮和卵巢和脈絡叢中表達。CRAPB2是視黃酸結合蛋白家族和脂鈣蛋白/胞質脂肪酸結合蛋白家族的成員,是一種小的細胞溶質蛋白,含有138個氨基酸殘基,但CRABP2與視黃酸的結合力遠不如CRABP1。該蛋白是一種從細胞質到核的穿梭蛋白,在與視黃酸結合后大量發生核定位,增強核受體的轉錄活性,核受體與它共享一個共同的配體,即視黃酸受體 (RAR),它通過將視黃酸輸送到該受體來發揮作用。它以依賴于配體的方式與 RAR 相互作用;在視黃酸的存在下,CRABP2-RAR 復合物是一種短命的中間體。RAR 轉錄活性的增強直接源于 CRABP2 將視黃酸引導至受體的能力。可促進RA與其同源受體復合物結合并轉移至細胞核,增強核受體(Retinoic acid receptor,RAR)的轉錄活性[2]。

2 CRABPs在癌癥中的表達

2.1 肺癌 肺癌導致的死亡人數占全球癌癥相關死亡人數的1/4以上,近60%的肺癌患者在首診斷為晚期,肺癌最常見的類型是非小細胞肺癌(占87%)。黃海華等[3]發現CRABP2在95-D肺癌細胞中較高表達,干擾CRABP2的表達明顯降低全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)對95-D細胞的抑制作用,CRABP2高表達能夠增強95-D細胞對ATRA的敏感性。此外,干擾 CRABP2后G1期細胞比例顯著增加,而S期細胞減少,提示CRABP2除了可以介導 ATRA的效應之外,可能還參與細胞增殖的調控。CRABP2調節p38、ERK1/2和JUN等通路可以調控肺部細胞分化與增殖。活化的NF-κB也可以促進腫瘤生長,干擾CRABP2后,95-D細胞中NF-kBp65的總蛋白表達不受影響,但其磷酸化水平明顯降低, SAPK/JNK和c-JUN的表達及磷酸化水平也有所降低。表明CRABP2的高表達也可以通過激活NF-kBp65和SAPK/JNK信號通路促進癌細胞的增殖。Wu等[4]發現CRABP2在轉移增強的肺癌細胞中表達上調,CRABP2高水平與肺癌患者的晚期、總體生存率差和復發相關。CRABP2通過HUR(類胚胎致死性視覺基因1)和整合素β1/FAK/ERK信號促進遷移、侵襲和失巢抵抗。此外CRABP2可能是一種潛在的肺癌預后生物標志物,也可能成為抑制轉移、增強吉西他濱和伊立替康對轉移性肺癌細胞抑制作用的治療靶點[4]。杜鵬研究指出血清中CRABP2的表達量檢測可作為早期原發性支氣管肺癌的潛在標志[5]。Kim等[6]發現血漿CRABP2水平隨著TNM分期的增加而增加,血漿CRABP2高水平與非小細胞肺癌患者的不良預后相關,血漿CRABP2水平可能是非小細胞肺癌的一種新的診斷和預后標志物。

2.2 乳腺癌 乳腺癌是女性中最常見的癌癥,三陰性乳腺癌指雌激素受體陰性、孕激素受體陰性和人表皮生長因子受體2陰性,占浸潤性乳腺癌的10%～20%。Liu等[7]指出與正常乳腺組織相比,CRABP1在雌激素受體陽性乳腺腫瘤中的表達顯著下調,在三陰性乳腺癌中表達不變。CRABP1高水平的患者預后差、Ki67免疫反應性高和腫瘤分級高。CRABP1通過滯留RA在細胞質中而減弱RA誘導的細胞生長停滯,抑制了RA在乳腺癌細胞中的信號傳導。CRABP1還影響RA生物合成,運輸和代謝的基因的表達,影響乳腺癌細胞對RA信號的響應[7]。陸進等[8]指出CRABP2在乳腺癌組織與細胞中高表達,且與乳腺癌患者生存預后不良相關。劉倩等[9]指出在乳腺浸潤性導管癌中,表皮型脂肪酸結合蛋白(E-FABP)在腫瘤中的陽性表達率較CRABP2高, 伴有癌轉移、TNM分期晚的腫瘤陽性率更高。腫瘤細胞中CRABP2/E-FABP 的比例決定著細胞的增殖和對RA 的敏感性,調節腫瘤細胞中CRABP2/E-FABP的比例有望成為乳腺癌個性化靶向治療研究的新方向,為臨床乳腺癌的治療及基因靶向藥物的研制提供重要依據[9]。Ju等[10]指出CRABP2 在乳腺浸潤性導管癌和良性乳腺纖維瘤中度或強表達。4-氨基-2-三氟甲基-苯基視黃酸酯可能通過上調 CRABP2 來抑制增殖,并通過下調乳腺癌細胞中的 FABP5 來抑制侵襲和遷移。這有助于在乳腺癌中使用分化療法[10]。

2.3 肝癌 肝細胞癌是發生在肝臟中的最惡性腫瘤之一,大多數肝細胞癌患者發現時已是晚期。 Chen等[11]研究指出隨著腫瘤分期的發展,肝癌組織中CRABP2的表達水平升高,而在肝癌細胞系中CRABP2的表達水平也升高。shRNA敲低CRABP2導致體外抑制腫瘤增殖,遷移和侵襲,隨后增加腫瘤凋亡相關蛋白的表達并降低ERK/VEGF途徑相關蛋白的表達。肝細胞癌細胞中的CRABP2沉默也抑制腫瘤在小鼠體內發展。CRABP2可以用作新型診斷生物標志物,調控CRABP2在肝癌中的作用可能為肝癌治療提供一個潛在的分子靶點[11]。

2.4 胰腺癌 胰腺癌是全世界的癌癥死亡的主要原因之一。胰腺導管腺癌(PDAC)是最常見的胰腺癌類型。PDAC早期轉移導致臨床效果差。Tsai等[12]指出CRABP1的高表達與淋巴結轉移和胰腺神經內分泌腫瘤分化差及等級高有關,它在間充質和神經內分泌腫瘤中的有促腫瘤發生和促轉移活性,是臨床中較有前景的生物標志物。Yu等[13]研究發現在胰腺導管腺癌細胞中缺失CRABP2并不影響癌細胞的增殖,而是減少了細胞的遷移和侵襲?；虮磉_芯片分析發現IL-8是在CRABP2缺失后顯著下調的基因之一。CRABP2能夠與HuR(類胚胎致死性異常視覺基因1)形成復合物,與IL-8信使RNA(mRNA)的3’UTR結合,增強IL-8 mRNA的穩定性。在CRABP2敲除細胞中異位表達CRABP2可以挽救IL-8、MMP-2/MMP-14的表達,恢復細胞遷移。CRABP2缺失會阻礙腫瘤轉移到附近的淋巴結。CRABP2可能作為胰腺導管腺癌的一個新的治療靶點。所有原發性胰腺導管腺癌和部分癌前病變均過度表達CRABP2,而正常的胰腺實質,導管上皮或慢性胰腺炎均不表達CRABP2。CRABP2通過調節IL-8/MMP-2/MMP-14途徑增強癌細胞的遷移和侵襲[14]。

2.5 腦膠質瘤 膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤,患者總體預后較差。近10余年發現,膠質瘤內的膠質瘤干細胞為放、化療抵抗及腫瘤復發的根源。在眾多的促分化藥物中,維甲酸(RA)因促白血病干細胞的分化效應而在膠質瘤的研究中受到關注。曾令成等[15]表明CRABP2蛋白是細胞內維甲酸的結合轉運蛋白,負責將維甲酸轉運至維甲酸受體信號通路,有促細胞分化及凋亡功能。在腦膠質瘤中,CRABP2蛋白表達與膠質瘤惡性級別呈顯著負相關,并可能介導了膠質瘤細胞對維甲酸的分化抵抗效應[15]。Liu等[16]指出CRABP2通過上調小型熱激蛋白(CRYAB)和星形膠質細胞特異性中間絲蛋白(GFAP)來抵抗RA信號傳導和動作,從而觸發MG細胞的抗凋亡或細胞保護反應,這確定參與RA生物利用度調節的蛋白在亞細胞定位中預測RA反應的重要性。CRABP2是多形性膠質母細胞瘤(GBM)患者臨床預后的重要決定因素,CRABP2在GBM中的作用機制是將RA阻斷在細胞質中和激活抗凋亡藥物途徑,從而增強增殖并防止RA介導的細胞死亡和分化。降低CRABP2水平可以增強GBM患者的RA治療指數[16]。

2.6 甲狀腺癌 Celestino等[17]指出CRABP1在濾泡狀甲狀腺癌、甲狀腺乳頭狀癌(及其變異體)以及所有 10 種甲狀腺癌細胞系中的表達顯著低于正常甲狀腺和濾泡性甲狀腺腺瘤。CRABP1的低表達可能是具有可疑惡性腫瘤的甲狀腺腫瘤的有用診斷生物標志物[17]。Liu等[18]指出白藜蘆醇能夠消除CRABP2甲基化,從而提高甲狀腺變性癌細胞THJ-11T和人髓母細胞瘤UW228-2細胞系對RA的敏感性。

2.7 其他腫瘤 膀胱癌(BC)是人類泌尿生殖道的第二大最常見惡性腫瘤,其特點是復發率高,但仍無診斷或監測人類BC的理想生物標志物。Jin等[19]研究發現與鄰近的非腫瘤組織相比,BC組織中CRABP2和FABP5顯著增加,具有較高的MASCOT評分和序列覆蓋率。在Western印跡中,在所有32種膀胱腫瘤組織裂解物中CRABP2和FABP5均過表達。CRABP2和FABP5在BC組織中上調,并且CRABP2和FABP5可能作為BC的潛在新生物標記[19]。

食管鱗狀細胞癌(ESCC)是在中國特別是河南省的主要食管癌(EC)型,預后較差,五年生存率有限。細胞視黃酸結合蛋白2(CRABP2)是視黃酸(RA)和脂鈣蛋白/胞質脂肪酸結合蛋白家族的成員,在視黃醛信號通路中的腫瘤發生中起著完全相反的作用。Yang等[20]研究表明CRABP2在食管鱗狀上皮腫瘤發生中起著抑癌作用,CRABP2在mRNA和蛋白水平在食管鱗狀細胞癌組織中明顯下調,并與 TNM分期,大小,腫瘤的浸潤深度和細胞相關。CRABP2通過抑制細胞生長,誘導細胞凋亡和阻斷細胞轉移,在食管鱗狀細胞癌變中起抑癌作用。CRABP2可能是診斷和預測食管鱗狀細胞癌發展的有效分子[20]。

腎母細胞瘤或威爾姆斯瘤是兒童中最常見的腎癌,占該年齡組腎腫瘤的98%。其中有一個亞組患者易復發和死亡。視黃酸(RA)途徑對細胞分化及其抗增殖,抗氧化和促凋亡活性具有影響,在化學預防和腫瘤治療中起著重要作用。Gupta等[21]描述了CRABP2在腎母細胞瘤晚期癌癥階段(Ⅲ/Ⅳ期)表達增加,轉移患者中RARA和CRABP2的表達增加,提示CRABP2在腎母細胞瘤中的細胞遷移和侵襲中的作用。在接受手術前化學療法的患者和患有轉移性疾病的患者中,RARA和CRABP2的免疫表達分別升高,對標記RARA和CRABP2進行的半定量和定量分析表明,它們具有潛在的生物標記作用,可用于腫瘤進展以及參與腎母細胞瘤的發生[22]。

宮頸癌(CC)是女性惡性腫瘤的世界第四大死因。宮頸癌腫瘤抑制基因的啟動子甲基化譜通常被甲基化,從而促進癌癥發生與發展。人乳頭瘤病毒(HPV)癌蛋白(例如E6和E7)的存在會增加DNA甲基轉移酶的活性并引起整體甲基化。Arellano-Ortiz等[23]指出宮頸癌組織CRABP1基因啟動子甲基化水平增強,基因表達降低,提示CRABP1可能作為腫瘤抑制基因參與腫瘤進展,但具體機制尚不清楚。

2.8 卵巢癌 卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一,雖然發病率很低,但卻是死亡率最高的婦科惡性腫瘤。卵巢癌早期缺乏癥狀和體征,導致診斷延遲,約75%患者被確診為卵巢癌時已為晚期,卵巢癌的標準治療包括手術和鉑類化療。目前,卵巢癌的5年生存率約為 47%,主要是由于復發和化療耐藥[24]。因此卵巢癌的早期診斷和治療的新靶點是卵巢癌研究重點之一。根據組織來源,卵巢腫瘤可分為上皮細胞瘤,間質內分泌細胞瘤和生殖細胞瘤等不同類型。上皮性卵巢癌在組織病理學上分為漿液性,子宮內膜樣,粘液性和透明細胞癌。這些亞型在其致癌機制、癌前病變、危險因素各方面有所不同。Persaud等[25]發現 CRABP1 在人卵巢癌細胞系 A2780 和小鼠胰腺導管癌細胞系 KPC 中表達丟失。CRABP1 在介導atRA非基因組活性中的生理作用,它的特異性配體可以在不涉及RARs的情況下誘導atRA的非基因組作用。CRABP1可以通過非典型激活 ERK1/2 來發揮腫瘤抑制因子的作用,誘導凋亡途徑,抑制抗細胞凋亡,導致癌細胞死亡[26]。Toyama等[27]研究指出CRABP2在卵巢漿液性癌中特異性地高表達,并通過視黃酸使細胞對抗增殖信號轉導敏感。CRABP2在卵巢透明細胞癌中幾乎完全不存在,在子宮內膜異位癥組織中低表達。CRABP2在透明細胞癌中表達低可能是由于它的分化特點,也可能與子宮內膜異位癥來源的癌細胞有關。在透明細胞癌中,與CRABP2競爭的RA信號轉導子FABP5的水平略有下調,但在其他亞型中通常是一致的,表明CRABP2不依賴于其他維甲酸信號通路而被解除調控。在星形膠質細胞瘤中也有類似的失調報道,其中CRABP2表達與不良預后相關[27]。

我們課題組利用生物信息學整合多個轉錄組數據對比分析,發現卵巢癌組織中視黃酸結合蛋白CRABP2基因表達水平比正常卵巢組織顯著升高,臨床樣本分析發現CRABP2在卵巢癌中高表達,CRABP2不僅與腫瘤惡性程度正相關,而且與癌癥的不良預后相關。CRABP2在卵巢癌的診斷中比目前使用的生物標記物CA125有更好的表現。我們提取了卵巢癌患者血清與正常健康志愿者血清中的外泌體,檢測發現CRABP2存在于血清外泌體中并且癌癥患者明顯升高,表明使用常規的生化手段檢測CRABP2就能夠反應卵巢癌的病程進展,具有良好的應用前景。CRABP2不僅在卵巢癌中較高表達,而且與癌癥預后不良有關。我們證實CRABP2是一種外分泌體蛋白,通過深入研究CRABP2在卵巢癌中的表達特點及其功能,CRABP2有望成為卵巢癌的診斷和預后標志物。

3 結論與未來展望

腫瘤是全球第二大死亡原因,生物標志物對于腫瘤早期發現和預后判斷,及選擇有效和適當的治療手段有重要意義。ATRA(全反式維甲酸)是維生素A的主要活性成分,在生長發育、細胞分化增殖、生殖、神經元功能、視覺等生物過程中發揮著廣泛的作用[28]。ATRA也用于某些治療目的,通過與RARs(視黃酸受體)結合來調節基因表達,發揮其典型活性。在進入細胞核作用于RARs之前,ATRA在細胞質中被CRABP1和CRABP2結合。CRABP1阻斷ATRA并調節其代謝,而CRABP2則將ATRA結合并傳遞給RARs,促進細胞分化及凋亡功能[25]。CRABP2近來報道與腫瘤表達有密切關系,且與病人預后相關。本文綜述了關于CRABPs在腫瘤中的研究進展。

CRABP1對維甲酸的胞內活性沒有影響,但能夠激活類維甲酸信號。在某些人類上皮性腫瘤如結腸直腸癌、肝細胞癌、甲狀腺癌和腎細胞癌中,CRABP1啟動子高甲基化或CRABP1 mRNA水平下降。而食管鱗狀細胞癌中CRABP1表達的降低與遠處轉移有關,并與漿液性和透明細胞卵巢腺癌的不良預后有關[29,30]。提示它可能是一種潛在的腫瘤抑制因子[31-34]。相反,CRABP1在子宮內膜樣卵巢癌和高浸潤性低分化子宮內膜腺癌中高表達[35,36]。

CRABP2在多種人類癌癥中異常表達,包括乳腺癌,卵巢癌,前列腺癌,膀胱腫瘤,神經母細胞瘤,神經膠質瘤,頭頸鱗癌,急性早幼粒細胞白血病和腎細胞癌等。CRABP2表達是在某些癌癥類型上調或以其它形式下調。CRABP2在多種腫瘤中均有異常表達,它們之間存在著明顯的異質性[3]。CRABP2在腫瘤發生中既起促進作用,也起抑制作用。見表1。

表1 CRABPs調控腫瘤進展的分子機制

我們應用綜合分析的方法,尋找新的卵巢癌外泌體生物標志物,發現CRABP2不僅在卵巢癌中較高表達，而且與癌癥預后不良有關。CRABP2有望成為卵巢癌的診斷和預后標志物。CRABPs是腫瘤中有潛力的分子,在腫瘤中高表達,可以作為分子標志物判斷腫瘤進展快慢,但是它如何促進腫瘤進展具體機制不詳。盡管CRABP2在多種腫瘤中均有異常表達,但對CRABP2的研究仍處于起步階段。它們之間存在著明顯的異質性。我們綜述的CRABPs在腫瘤中的研究最新進展,深入研究CRABPs在各類腫瘤中的功能與作用機制,對于開發基于此靶點的腫瘤分子標志物與優化治療手段有重要意義。