擴展性無創產前檢測在染色體微缺失微重復的臨床應用價值

呂曉曉，李煥錚，唐少華

溫州醫科大學定理臨床學院 溫州市中心醫院 檢驗科，浙江 溫州 325000

染色體微缺失微重復綜合征（chromosome microdeletion/microduplication syndrome, MMS）是由染色體微小片段缺失或重復引起的一類遺傳性疾病。已知MMS涵蓋了300多種類型，患者常表現出特殊面容、智力發育異常、精神行為異常、生長發育遲緩、自閉癥等[1]。

1997年，香港中文大學盧煜明教授團隊首次在孕婦的外周血中發現含有胎兒的游離DNA片段（cell-free fetal DNA, cffDNA）[2]，這一發現開創了產前篩查的新模式。從2011年起，基于cffDNA的無創產前檢測（noninvasive prenatal testing,NIPT）已廣泛應用于臨床。2016年，美國醫學遺傳學和基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）推薦NIPT可以替代常規篩查模式[3]。然而，目前NIPT的檢測范圍僅限于常見的13、18、21-三體，而擴展性NIPT（expanded noninvasive prenatal testing, NIPT-plus）不僅能檢測這三種染色體非整倍體，還能篩查其他97種胎兒染色體異常疾病，其中包括17 種胎兒染色體非整倍體，其中涵蓋4種性染色體異常（45, X、47,XXY、47, XXX、47, XYY）以及其他13種常染色體非整倍體；此外，還包括7種大于3 MB的遺傳綜合征，如1p36缺失綜合征、2q33.1缺失綜合征、22q11.2 缺失綜合征、Angelman綜合征、Cri-Du-Chat綜合征、LangerGiedion綜合征、Prader-Willi綜合征；最 后，NIPT-plus還能檢測76種大于10 MB的胎兒染色體大片段的缺失重復綜合征。

盡管關于NIPT-plus在常見三體的檢測能力已有許多報道，但對于篩查MMS的檢測效能及其臨床應用價值的相關文獻報道較少。因此，本研究收集NIPT-plus檢測MMS高風險的孕婦，通過回顧性分析NIPT-plus和染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis, CMA）結果以及隨訪結果，評估NIPT-plus在MMS篩查中的檢測效能，為MMS高風險孕婦提供更可靠的遺傳咨詢。

1 對象和方法

1.1 研究對象 收集2020年1月至2023年6月在溫州市中心醫院進行NIPT-plus檢測的5 027例孕婦的臨床資料。年齡為16～53歲，高齡孕婦（＞35歲）共占42.59%（2 141/5 027）。收集所有病例中高風險的NIPT-plus檢測結果，并對其進行妊娠結局的隨訪。本研究經過溫州市中心醫院倫理委員會審批（L2023-03-027），并確保所有孕婦在參與研究前簽署了《檢測知情同意書》和《保險知情同意書》。

1.2 方法

1.2.1 NIPT-plus檢查：用EDTA抗凝管抽取孕婦10 mL外周血，離心后收集上層血漿，采用北京貝瑞公司生產的DNA提取試劑盒提取cffDNA，構建文庫，通過Illumina高通量基因測序平臺進行樣本測序檢測，產出的原始測序數據量約為NIPT的5倍，將測序序列與人類基因組參考序列圖譜進行比對，并剔除GC異常區域、低覆蓋度區域，進行數據量歸一化，使用主成分分析法（principal-componentanalysis,PCA）來降低序列數分布的偏差，使用隱馬爾可夫模型（hidden Markov model, HMM）進行拷貝數變異（copy number variation, CNV）的檢測。

1.2.2 CMA檢查：對NIPT-plus檢測結果高風險孕婦，召回并告知侵入性產前診斷風險。在超聲引導定位下，常規消毒后于孕16～24 周行羊膜腔穿刺術抽取羊水10 mL。采用德國QIAGEN公司DNA提取試劑盒提取羊水基因組DNA進行檢測，用美國Affymetrix公司生產的Affymetrix CytoScan 750k芯片檢測，用Chromosome Analysis Suite Software（ChAS）軟件分析。

1.2.3 隨訪：對NIPT-plus檢出MMS高風險孕婦通過電話隨訪，孕產婦健康管理電子信息系統查詢，孕產婦保健手冊查閱等方式明確孕婦妊娠結局信息。

2 結果

2.1 孕婦基本情況 共計5 027例孕婦納入研究，將孕婦的年齡分成5類，≤24歲238例，25～29歲1 191例，30～34歲1 457例，35～39歲1 682例，≥40歲459例，其中＞35歲高齡孕婦有2 141例，占42.59%。NIPT-plus檢出MMS高風險54例，其中＞35歲高齡孕婦有24例，占44.45%。CMA確診14例，其中＞35歲高齡孕婦有7例，占50%，見圖1。

圖1 孕婦年齡分布

2.2 NIPT-plus篩查結果以及妊娠結局 在5 027例樣本中，檢出21-三體、18-三體、13-三體、性染色體異常、微缺失微重復高風險總共94例，陽性率為1.87%。其中檢出21-三體18例，其中3例拒絕產前診斷，對3例孕婦進行跟蹤隨訪，1例引產，1例失聯，1例生育唐氏兒；CMA確診21-三體14例，總體陽性預測值（positive predictive value, PPV）為93.33%（14/15）。檢出18-三體2例，其中1例孕婦拒絕進一步診斷，隨訪孕婦已胎停，另1例CMA確診。檢出13-三體1例，進一步診斷結果為陰性。檢出性染色體非整倍體異常19例，3例孕婦拒絕進行侵入性產前診斷，跟蹤隨訪，1例生產健康胎兒，1例死胎，1例失聯，確診6例，PPV為37.5%（6/16），其中一例為嵌合體（45, X[36]/47, XXX[4]）。檢出MMS高風險有54例，19例孕婦拒絕進行侵入性產前診斷，最終入組MMS高風險孕婦35例，CMA確診14例，其中2例為NIPT-plus檢出外的其他異常，PPV為40%（14/35），見表1。

表1 NIPT-plus檢測5027例高風險孕婦的胎兒情況

2.3 NIPT-plus與產前診斷結果的符合情況 NIPTplus篩查提示MMS高風險的孕婦群體中，通過CMA實證了14例。其中12例的CMA結果與NIPT-plus的預測相吻合，見表2；2例為NIPT-plus未能捕獲的其他異常，見表3。經CMA驗證，根據ACMG和ClinGen專家共識及臨床建議，4例判定為致病性變異，5例為疑似致病變異，5例意義未明。

表3 CMA與NIPT-plus結果不符合的2例胎兒情況

2.4 隨訪結果 19例NIPT-plus檢測提示MMS高風險的孕婦拒絕產前診斷，隨訪胎兒結局：1例失訪，5 例選擇終止妊娠，其余13 例均胎兒正常。21 例NIPT-plus檢測結果高風險CMA正常的孕婦，隨訪胎兒發現均正常。

3 討論

目前，在臨床實踐中，染色體缺失和重復的產前診斷仍主要依賴于侵入性檢測手段。然而，隨著全基因組測序技術的進步，NIPT技術現已被用于該領域的檢測工作。近幾年，NIPT-plus作為升級版的無創產前篩查技術被推廣使用，它不僅可以篩查常見的染色體非整倍體，還可用于檢測其他染色體的非整倍體及MMS[4]。國際產前診斷協會 （International Society for Prenatal Diagnosis, ISPD）和ACMG聯合聲明，NIPT-plus可用于對明確的MMS進行研究性檢測，并適用于所有人群的產前篩查[5-6]。ACMG指南建議，孕婦應進行常規的MMS篩查，大樣本人群研究認為胎兒的染色體MMS發生與孕婦的年齡無關，并且比非整倍體更常見[7]。本研究結果顯示在NIPT-plus檢出MMS高風險的孕婦中，大于35歲的孕婦占44.45%，小于35歲的孕婦占55.55%，經CMA確診MMS的孕婦中，大于35歲和小于35歲孕婦各占50%，提示MMS的發生與年齡無緊密關聯，與之前的報道一致。

近幾年，研究學者對NIPT-plus在MMS篩查中的應用進行了深入探討，但不同研究對NIPT-plus在篩查MMS的檢測準確性的報道存在一定差異，PPV為40%～59%[8-11]。在2019年的一項研究中，LIANG 等[8]使用NIPT-plus對94 085例孕婦的外周血進行非整倍體和全基因組MMS篩查，其結果顯示MMS的陽性率為0.174%，PPV為40.8%（49/120）。2021年4 月[9]，第6屆胎兒醫學臨床基本技能培訓班暨第2屆國際產前診斷協會培訓課程公布了近30萬例NIPTplus檢測的臨床隨訪數據。這些數據顯示，MMS的PPV為59%。在2022年的一項研究中，XUE等[10]使用NIPT-plus在31 256例單胎妊娠婦女中進行了染色體微缺失和微重復的檢測，結果表明MMS的陽性率為0.71%，PPV為55.56%（15/27）。2023年ZOU等[11]在江西省婦幼保健院針對23 116例行NIPT-plus檢測的樣本進行了胎兒非整倍體和CNV的性能研究，結果顯示MMS的陽性率為0.13%，PPV為50%（8/16）。本研究5 027例接受NIPT-plus檢測的孕婦中，有54例顯示為MMS高風險，陽性率為1.07%，總體PPV為40%，這與文獻報道[8]中的數據相似。

NIPT-plus檢出16p13.11-p12.3區域2.7 MB缺失1 例，該區域涉及到12 個蛋白編碼基因，其中9個是OMIM相關基因，涉及16p13.11 recurrent microdeletion綜合征，到目前為止，已報告了超過100例16p13.11微缺失患者，缺失范圍從162 kB到5.5 MB[12-13]。HANNES等[14]使用BAC array CGH篩查了1 027 例智力低下和/或多發性先天性畸形患者，發現1例16p13.11缺失的患者進行了三人組分析，結果顯示該缺失遺傳自表型正常的父親。其余存在16p13.11缺失的患者臨床表型多樣，并發現2 例產前診斷的胎兒均存在腦部結構異常，其中1例為前腦無裂畸形，另1例為側腦室擴張伴其他不同程度的先天畸形。該孕婦因為年齡高風險進行NIPT-plus檢測，超聲結果未見異常，且缺失區域來源于表型正常孕婦，故孕婦選擇繼續妊娠，隨訪妊娠結局，胎兒未見異常，也提示16p13.11缺失可能會引起神經異常表型，但也可能是神經認知疾病的易感位點，但在得出明確結論之前，致病性需要進一步的研究。

另一方面，盡管NIPT-plus檢測可以顯著提高胎兒染色體異常的檢出率，但存在假陽性或假陰性結果。在2017年柯瑋琳等[15]的報道中，14 235例中無創檢出15例MMS，其中2例為假陽性結果。在2020年王梓茗等[16]的報道中，37 845無創檢出27例，其中7例為假陰性結果。本研究提示兩例NIPT-plus與CMA結果不符合，其中1例孕婦NIPT-plus檢測結果顯示4q34.1-q34.3區域缺失5.7 MB，但是CMA結果顯示1p36.21-p36.13區域重復1.32 MB，根據ACMG和ClinGen專家共識及臨床建議判定為臨床意義未明，隨訪孕婦選擇繼續妊娠，并生育一健康兒。另1例NIPT-plus顯示22q11.21區域重復2.4 MB，而CMA結果顯示22q11.21重復2.40 MB，Xp22.31缺失 1.63 MB，因Xp22.31缺失涉及STS綜合征，主要臨床表型為四肢、面、頸、軀干、臀部大面積鱗屑，部分患者可出現角膜渾濁、支氣管哮喘和性器官發育異常等癥狀，隨訪孕婦選擇終止妊娠。目前認為NIPT-plus假陰性或假陽性結果的原因可能與母親的染色體異常，胎兒游離DNA比例過高或過低、母源性腫瘤、局限性胎盤嵌合（confined placental mosaicism, CPM）等有關[17]。其中，母親自身攜帶的拷貝數變異是造成假陽性結果最常見原因[18]，建議采集NIPT-plus同時采集母親DNA進行檢測，既可有效降低假陽性的發生，又可明確遺傳性變異來源，本研究兩例孕婦不愿提供本人及配偶的血液，無法進行進一步驗證，故難以確定假陽性結果是否來自母親。

總的來說，NIPT-plus與常規NIPT檢測比較，可以發現更多的染色體微缺失微重復，NIPT-plus與產前診斷CMA在檢測MMS方面具有較高的一致性。NIPT-plus作為一種新的篩查技術，其檢測結果可以為臨床醫師和孕婦提供重要的參考，有助于識別高危孕婦，從而在妊娠期間和出生后提供更好的臨床管理。這對于預防出生缺陷、避免孕婦身心傷害、減輕家庭和社會經濟負擔具有重要的意義。