豬脫細胞真皮基質對大鼠瘺管模型的修復作用及其對TGF-β1/NF-κB p65信號通路的影響

林瓊瓊，孟洪冰，金純，周崇俊，宋張娟

1.溫州醫科大學附屬第二醫院 病理科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學 基礎醫學院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫科大學附屬第二醫院 肛腸外科，浙江 溫州 325027；4.上海醫藥職工大學 培訓部，上海 200092

肛門瘺管是臨床常見的肛腸疾病之一，一項統計分析顯示，肛瘺發病率為每1萬人中有1.69例[1]。 起因主要為肛周膿腫破潰或切開引流術后未愈形成，以病程纏綿難愈為特點，伴有流膿、疼痛、瘙癢等癥狀。目前治療方法以外科手術為主，包括括約肌保留手術、直腸黏膜瓣內口修補手術以及填充物封堵瘺管手術[2]。但在臨床上經常遇到肛瘺術后創面愈合不良，其根本原因在于肛周膿腫破潰后竇道尚未形成期間，炎癥尚未退散，盲目進行瘺管手術，導致竇道與膿腔均受到影響，致使創面難以愈合[3]。隨著生物材料的發展，許多新的技術已經用來治療難愈性肛門瘺管。

豬脫細胞真皮基質（porcine acellular dermal matrix, pADM）是一種韌性及強度較好的植入型生物組織材料，以豬皮為原料，經脫細胞與病毒滅活等工藝制備而成，為一種多孔性的三維網狀結構，主要成分為膠原蛋白。由于pADM與人類脫細胞真皮基質相似，具有良好的生物相容性以及低免疫原性，因此它可以作為臨床應用中人類ADM的替代品[4]。 2005年，馬忠鋒等[5]在動物實驗中證明了pADM可以加速傷口修復。目前，pADM被廣泛應用于臨床組織修復，特別是在真皮組織置換和組織再生支架領域。這主要是由于pADM在促進成纖維細胞、膠原蛋白和血管再生方面的重要作用[6]。但是關于pADM在肛門瘺管中的作用機制尚不明確。

本研究通過構建大鼠瘺管模型，檢測各組血清炎癥因子含量以及創口組織TGF-β1/NF-κB p65信號通路相關蛋白的表達，觀察pADM對瘺管模型創面的修復作用，以及對其作用機制的初步探討。本研究發現，植入pADM可更好地減輕瘺管創口的炎癥反應，促進血管和膠原纖維的生成。pADM作為一種生物相容性材料，在肛門瘺管的治療中有廣闊的應用前景。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級健康雄性SD大鼠40只，體質量220～250 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（浙）2019-0001。適應性飼養1周后開始實驗。

1.1.2 主要材料和試劑：pADM（專利號ZL 2016 1 0890806.1，深圳華臻生物科技有限公司）；瘺管栓（瑞栓寧，T型/SIS-T5，批號200701，西安瑞盛生物科技有限公司）。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）抗體購于美國Proteintech公司；轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、核轉錄因子-κB p65（nuclear factor-κB, NF-κB p65）抗體購于美國Abcam公司；白介素-6（interleukin-6, IL-6）、白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、VEGF、前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）等酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒購于深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備：40只SPF級SD大鼠隨機分為假手術對照組、模型組、pADM組（真皮組）和瘺管栓陽性對照組（瘺管栓組），每組10只。參照王琛等[7]方法制作動物瘺管模型，假手術組使用0.9%氯化鈉溶液，其余3組使用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合液。

1.2.2 給藥方法：真皮組：取pADM支架材料（3 cm× 3 cm）填充瘺道，縫合創口；瘺管栓組：取瘺管栓 （3 cm×3 cm）填充瘺道，縫合創口，每日觀察瘺道恢復情況并記錄，直至材料被吸收；每組均治療2周。

1.3 檢測指標 ELISA法檢測大鼠血清中IL-6、IL-1β、VEGF和PGE2含量，HE染色觀察創面組織病理改 變，Western blot法檢測創面組織TGF-β1、NF-κB p65和VEGF蛋白表達。

1.4 統計學處理方法 應用SPSS25.0軟件進行統計處理。正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用Bonferroni法，非正態分布計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用秩和檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠體質量和創面改變 治療前，造模4周后，與假手術組大鼠相比，模型組、真皮組、瘺管栓組大鼠的體質量下降（P＜0.05），創面膿液色黃、質稠、量多。治療2周后，真皮組、瘺管栓組大鼠體質量較模型組明顯增加（P＜0.05），創面膿液明顯減少。真皮組和瘺管栓組比較，大鼠的體質量變化差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1和圖1。

圖1 各組大鼠創面改變圖像

表1 各組大鼠體質量變化情況比較（每組n=10，g）

2.2 大鼠創面組織病理改變 治療2周后，HE染色發現，假手術組創面見較多毛細血管，少量炎癥細胞浸潤創面，并見少量纖維細胞和成纖維細胞。模型組創面均可見大量炎細胞浸潤。真皮組、瘺管栓組與模型組比較，炎性浸潤均明顯減少，膠原纖維增多，其中真皮組膠原纖維較瘺管栓組更多更致密（見圖2）。

圖2 各組大鼠創面組織的HE染色結果（×200）

2.3 大鼠血清中IL-1β、IL-6、PGE2和VEGF含量比較 治療2周后，與假手術組相比，模型組、真皮組及瘺管栓組IL-1β、IL-6和PGE2含量升高（P＜0.05），VEGF含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，真皮組及瘺管栓組的IL-1β、IL-6和PGE2含量降低（P＜ 0.05），VEGF含量升高（P＜0.05）；瘺管栓組和真皮組間IL-1β、IL-6、PGE2和VEGF含量的差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 治療2周后各組大鼠IL-6、IL-1β、PGE2和VEGF含量的比較（每組n=10，pg/mL）

2.4 創面組織NF-κB p65、TGF-β1和VEGF蛋白的表達情況 治療2周后，Western blot檢測結果表明，與假手術組相比，模型組NF-κB p65蛋白表達升高，TGF-β1、VEGF蛋白表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，真皮組及瘺管栓組大鼠的NF-κB p65蛋白表達降低，TGF-β1和VEGF蛋白表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，真皮組和瘺管栓組NF-κB p65、TGF-β1和VEGF蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 治療2周后各組大鼠創面組織NF-κB p65、TGF-β1和VEGF蛋白表達

3 討論

肛門瘺管是肛管或直腸與肛門皮膚之間由于炎癥性腸病或肛周膿腫等原因出現肛周腫痛、瘙癢、破潰流膿，經久不愈而形成的瘺道。手術是治療肛門瘺管最常用最有效的方法，但如何在盡量保留肛門括約肌的前提下更好地提高術后創面愈合質量是臨床關注的問題。炎癥、膠原蛋白、新生血管及成纖維細胞共同營造的微環境是影響瘺管術后創面愈合的重要因素[8]。因此，提高術后創面愈合質量的關鍵在于減輕炎癥反應，促進膠原蛋白和新生血管形成及成纖維細胞的增殖，改善傷口局部血液循環。pADM是一種廣泛應用于組織修復的生物相容性材料，關于其在臨床上的應用研究較多，但是具體的作用機制仍在探索中。

本研究發現，植入pADM或瘺管栓治療后，大鼠體質量增加，創面膿液明顯減少，血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和PGE2含量減少，表明pADM和瘺管栓均明顯減輕瘺管創口的炎癥反應。進一步地，HE染色發現，pADM促進膠原纖維新生的作用較瘺管栓更加明顯。此外，研究表明，pADM具有低毒低致敏性以及更高的安全性和降解性，從而廣泛應用于組織缺損的外科修復重建[9]。相較于其他生物材料而言，pADM中的基質膠原纖維組分和結構與人體的真皮組織更加接近；誘導的新生組織可以規律分布于其膠原纖維框架內從而改善創面瘢痕攣縮[10]。以上結果提示，pADM具有和瘺管栓相同的促進創口愈合的作用，但其成分組成和結構特征，使得pADM具有更廣泛的臨床應用前景。進一步研究結果表明，pADM促進創口修復的作用機制可能是由于激活TGF-β1/NF-κB p65信號轉導途徑，導致瘺管中TGF-β1和VEGF表達增加，NF-κB p65表達減少所致。

研究表明，pADM可以模擬天然組織的細胞外基質，刺激免疫系統激活巨噬細胞，釋放一系列傷口愈合因子，如TGF-β1和VEGF等[11]。TGF-β1作為重要的成纖維細胞的強效趨化因子，通過動員成纖維細胞增殖，膠原合成及細胞外基質重塑，并誘導血小板-成纖維細胞結合，從而促進纖維化和瘢痕形成，加快傷口愈合速度[12-13]。此外，VEGF介導新生血管形成，在創傷愈合過程中有著重要的作用[14]。VEGF通過刺激內皮細胞的增殖、分化及遷移，能促進血管結構形成，慢性創傷修復中VEGF濃度與傷口愈合速度相關，VEGF上調有利于毛細血管新生和微循環系統重建，VEGF下調會導致血管生成減少從而延緩傷口愈合[15]。本研究結果顯示，pADM組及瘺管栓組TGF-β1、VEGF表達均升高，說明兩種材料都能促進新生血管的增生，刺激肉芽組織形成，從而達到加速創口愈合的作用。

既往研究發現，TGF-β1可刺激NF-κB p65從細胞質轉位到細胞核，參與組織修復[16-17]。NF-κB在細胞質中以失活的NF-κB/IκBα復合物存在，當IκBα發生磷酸化時，會釋放NF-κB轉運到細胞核中引起轉錄，NF-κB信號通路廣泛參與各種炎癥反應[18]，NF-κB表達降低是炎癥緩解的標志[19]，另一項研究也顯示，p50同型二聚體和p50/p65異質二聚體在膿毒性休克中有明顯的抗炎作用[20]。本研究發現pADM及瘺管栓均可導致NF-κB p65蛋白表達降低，提示兩種材料可能通過TGF-β1/NF-κB p65信號通路，減輕炎癥反應，為傷口的愈合提供良好的組織再生微環境。其具體機制尚有待進一步研究。

本研究具有一定的局限性，盡管我們的研究發現，真皮組血清中VEGF含量和創面組織中VEGF蛋白比模型組有明顯升高，但是關于pADM促進血管新生還有待于深入觀察和進一步驗證。

綜上所述，本研究證明了pADM抑制大鼠瘺管創口組織炎癥反應，促進膠原蛋白新生及創口愈合，進一步的結果表明其中的作用機制可能是通過TGF-β1/NF-κB p65信號通路進行調控。作為一種具有良好性能的生物材料，pADM在肛門瘺管的治療中發揮著巨大的臨床應用潛力。