酶法制備蛹蟲草多肽工藝優化及其體外抗氧化活性研究

龔 頻, 岳 山, 王小娟, 楊文娟, 姚文博, 陳福欣

(1.陜西科技大學 食品科學與工程學院, 陜西 西安 710021; 2.西安科技大學 化學與化工學院, 陜西 西安 710054)

0 引言

蛹蟲草是一種人工培養的藥食同源真菌,早在5世紀便被廣泛使用,蛹蟲草本身含有豐富的營養成分,包括核苷類、多糖類、糖醇、甾醇類以及SOD酶在內的多種有效成分,具有鎮靜催眠、提高機體免疫力、抗腫瘤、防止衰老、保護心肺組織等多種藥理作用[1],還有研究表明蛹蟲草活性功能物質在調節機體的各項生理機能和強身健體等方面都有著顯著的功效[1,2].有充分的研究表明蛹蟲草與冬蟲夏草具有相似的功能和藥效[1-3].蛹蟲草作為一味使用歷史悠久的傳統中藥之一,在藥學研究中具有很大的藥用價值,現代科學對其研究越來越多,涉及到蛹蟲草中的蟲草多糖、蟲草素、腺苷類等有效成分[3,4],但對蛹蟲草蛋白的研究較少.對人工栽培的蛹蟲草的成分進行分析,表明人工培養的蛹蟲草中蛋白質含量在30%左右,脂肪含量在8%,是一種高蛋白低脂肪的滋補佳品,一種優秀的蛋白補充劑,具有良好的開發前景[5-7].

堿提酸沉法是最常用的提取蛋白質的方法,利用的原理是植物蛋白易溶于堿性環境,在酸性等電點條件下析出.堿提酸沉法的優點是蛋白質的提取率和純度都較高,易操作,成本低;缺點是過高濃度的堿液會使部分提取出的蛋白質產生不可逆的變性,使得營養價值的降低.但通過酶解生成生物活性肽可恢復其營養價值,與蛋白質相比生物活性肽具有更加良好的理化性質、良好的水合性質以及更高的生物利用度[8,9].蛋白質經過酶解成為小分子多肽后,隨著蛋白質中氨基和羰基的暴露使得酶解后的多肽電荷分布改變,使得表面親水基團增多,溶解性增大[10,11].同時人體處于水環境因此蛋白質水解為多肽能顯著增加人體對多肽的吸收速度,提高蛋白質的生物利用度,同時多肽相較于蛋白質有更高的活性與多樣性,無論在吸收還是生物學功能上都有著顯著的優勢[12].

本研究以蛹蟲草作為原料,采用堿提酸沉法從蛹蟲草中提取蛋白質、確定最佳提取條件.通過單因素實驗與響應面分析確定蛹蟲草蛋白提取的溫度、pH 值、料液比等最優工藝指標,并分別針對蛹蟲草多肽的體外抗氧化活性進行測定與研究,以期為蛹蟲草蛋白的深加工以及生物活性肽的制備提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗原料

蛹蟲草超微粉,(經過超微粉碎后過300目篩);牛血清蛋白標準品,北京奧博星生物技術有限公司;

實驗藥品:考馬斯亮藍G250,上海源葉化學試劑有限公司;NaOH、無水乙醇、HCL、甲醛、三氯乙酸、雙氧水、鐵氰化鉀,天津市天力化學試劑有限公司,分析純.

實驗儀器:Varioskan fiash全波長掃描式多功能讀數酶標儀,賽默飛世爾科技有限公司;HGZF-101-2型電熱恒溫鼓風干燥箱,上海躍進醫療器械有限公司;FD-1D-50型真空冷凍干燥機,無錫郎寧儀器制造有限公司;MODEL808型pH計,美國奧麗龍公司;HH-2型電熱恒溫水浴鍋,金壇市江南儀器廠.

1.2 實驗方法

1.2.1 蛹蟲草蛋白的提取

稱取蛹蟲草粉末2.00 g放入燒杯中,按照一定料液比加入去離子水,攪拌均勻,使蛹蟲草粉末與水充分接觸混合.滴加1 mol/L的氫氧化鈉溶液,調節pH到最適提取酸堿度.然后放入一定溫度的水浴鍋中水浴浸提一段時間,抽率取上清液,取用1 mol/L的鹽酸調節pH值至等電點,常溫靜止一段時間,8 000 r/min離心20 min去掉上清液,獲得蛋白,用少量去離子水溶解蛋白并轉移至平皿中,冷凍干燥得到粗蛋白[13].

1.2.2 等電點測定

蛹蟲草蛋白粗提液用0.1 mol/L的鹽酸溶液調節其pH,在pH計的幫助下設計從3至5共10個點位分別為3、3.3、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.在5 000 r/min的轉速下離20 min,得粗蛋白質沉淀,冷凍干燥后稱重[14].

1.2.3 蛋白質提取工藝優化

(1)單因素實驗

取2 g蛹蟲草超微粉末于燒杯中,分別以料液比(1∶12、1∶14、1∶16、1∶18和1∶20 g/mL)、體系pH(8、9、10、11、12、13)、提取時間(60、90、120、150、180 min)三個因素進行單因素實驗,在研究某一因素時,其他因素固定不變,以蛋白質得率為指標進行單因素實驗研究分析.

(2)Box-Behnken 實驗

在單因素實驗基礎上,確定三因素三水平的最佳參數進行響應面分析[14-16].

1.2.4 蛋白質酶的篩選

選取胃蛋白酶(37 ℃ pH 2)、木瓜蛋白酶(52 ℃ pH 6.5)、堿性蛋白酶(50 ℃ pH 8.0)三種酶,分別將其置于最適的酶解條件對提取的蛹蟲草粗蛋白進行酶解,通過甲醛滴定法測定酶解液中多肽的相對含量,以此判斷每種酶的酶解效果[12,17].

1.2.5 酶解工藝流程

準確稱量蛹蟲草粗蛋白0.50 g,用蒸餾水調節底物濃度使料液比為1∶100,加入50 mL的蒸餾水.調節溶液酸堿度使得溶液pH值到蛋白酶最適pH,水浴溫度調節到各蛋白酶的最適溫度,加入等體積的蛋白酶(10% m/M),混合均勻后,酶解12 h,水解完成后沸水浴滅活10 min,即得到蛹蟲草蛋白的多肽水溶液[18,19].

1.2.6 抗氧化活性研究

(1)總還原力比較

分別取高、中、低(2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL)三種濃度的蛹蟲草多肽提取液和蛋白質溶液1 mL于試管中,依次加入2.50 mL pH 7.0的磷酸緩沖液、2.50 mL鐵氰化鉀溶液和1.50 mL蒸餾水混合均勻,在50 ℃的 條件下反應20 min,冷卻后加入2.50 mL的三氯乙酸(蛋白質溶液中加入2.50 mL蒸餾水),3 000 r/min條件下離心10 min,取上清液2.50 mL,再加入2.50 ml蒸餾水和0.50 mL三氯化鐵溶液,混合均勻后放置10 min.在波長為700 nm處測量其吸光值[20,21].

(2) DPPH自由基清除力的比較

分別取高、中、低(6 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL)三種濃度梯度的蛹蟲草多肽提取液和蛋白質溶液1 mL于試管中,添加1.50 mL的DPPH乙醇溶液.充分混勻后在室溫下反應30 min.在527 nm處測量紫外吸收值,進行比較[22].DPPH自由基的清除率為:

(1)

式(1)中:A1:DPPH溶液+待測液的吸光度;A2:95%的乙醇+待測液的吸光度;A3:DPPH溶液+蒸餾水的吸光度.

(3)羥自由基清除率

分別取高、中、低(6 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL)三種濃度的蛹蟲草多肽提取液和蛋白質溶液1 mL于試管中,分別加入2 mL FeSO4溶液和2 mL的水楊酸-乙醇溶液,加入1 mL的H2O2啟動反應,讓其置于37 ℃的水浴中反應30 min,待其冷卻于510 nm處測其吸光值[23,24].羥自由基清除率為:

(2)

式(2)中:A1:H2O2+待測樣品的吸光度;A2:H2O+待測樣品的吸光度;A3:H2O2+蒸餾水的吸光度.

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白質檢測

Bradford檢測法

將提取液稀釋一定的倍數,取稀釋液1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液溶液,充分混勻后常溫下反應10 min后,在波長為595 nm處測得其光吸收,計算蛋白質濃度.

1.3.2 甲醛滴定法

取2.50 mL的中性水解液,加入2.50 mL 10%的三氯乙酸,靜置10 min,在4 000 r/min的條件下離心15 min,取上清液5 mL,加入5滴30%的雙氧水,加入0.20 mol/L的氫氧化鈉溶液調節至pH 7,再用于0.02 mol/L氫氧化鈉滴定pH 8.1,加入10 mL的三氯甲醛溶液,靜置10 min,測量溶液pH,再用0.02 mol/L的氫氧化鈉緩慢地均勻滴定至溶液pH濃度等于8.1,并詳細記錄消耗的各種氫氧化鈉及其溶液的用量[18].

(3)

式(3)中:V:為待測液消耗標準NaOH的體積;C:標準NaOH的摩爾濃度.

所有數據均為3次重復試驗平均值±標準差,使SPSS19.0 軟件進行統計學分析,GraphPad 8.0.2進行繪圖,使用 Design-Expert8.0.6 進行響應面設計.

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 蛋白質等電點的測定

蛋白質是帶有正負電荷的兩性電解質,蛋白質處于等電點時,其凈電荷為零,由于相鄰蛋白質分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀.因此在其他條件相同時,它的溶解度達到最低點.由圖1可知,當pH為4.4時,粗蛋白質量為201.10±2 mg,達到最大值,蛋白提取液中沉降下來的粗蛋白質量最高,粗蛋白質得率達到最大值,由此可推斷出蛹蟲草蛋白質的等電點在4.4.

圖1 蛹蟲草蛋白質沉淀點測定

2.1.2 料液比對蛋白質提取的影響

由圖2可知,隨料液比的增大,蛹蟲草蛋白質的得率也增加,當料液比為1∶18時,蛋白質的提取率達到最大值9.17%.這是因為當料液比增大時,蛹蟲草粉末與溶液接觸面積增大,加速了蛋白質溶出,當溶液體積達到一定量時,可溶性雜志增多,降低蛋白質對溶劑的親和力,降低了提取率.因此,確定最適的料液比為1∶18.

圖2 料液比對蛹蟲草蛋白提取得率的影響

2.1.3 pH對蛋白質提取率的影響

由圖3可知,隨著體系pH的提高,蛹蟲草蛋白的得率逐漸變大,當pH為12時蛹蟲草蛋白的得率達到最大值10.01%±0.2%.這是因為蛹蟲草蛋白的溶解性,隨著溶液體系pH的增加而增大,當體系pH達到12時,蛋白質得率基本穩定.因此,蛹蟲草蛋白提取的最適為pH 12.

圖3 pH對蛹蟲草蛋白得率的影響

2.1.4 提取時間對蛋白質得率的影響

由圖4可知,蛹蟲草粗蛋白得率,隨著提取時間增加而增大,150 min時達到最大值.是因為在提取的初期由于提取時間較短,蛹蟲草粉末未充分與溶液接觸,蛋白質沒有完全析出.隨著提取時間的增加蛋白提取率逐漸趨于平穩.

圖4 提取時間對蛹蟲草蛋白得率的影響

2.2 響應面分析法優化提取工藝

基于單因素實驗結果擬確定的最佳條件,選取浸提時間、pH、和料液比三個條件進行Box-Behnken 實驗,三個因素分別以A、B、C代替,每個變量的低、中、高,試驗水平編碼分別為-1、0、1,如表1所示.

表1 試驗因素水平及編碼

根據Box-Behnken實驗設計原理進行響應面試驗,試驗設計方案與結果如表2所示.

表2 Box-Behnken 試驗設計方案與結果

對表2中的數據分析得到蛋白提取液中蛋白質濃度試驗數據進行多元回歸擬合,獲得提取液中蛋白質濃度對編碼自變量的二次元多項回歸模型如式(4)所示:

Y=5.32+0.23A+0.11B+0.2C-0.053AB+
0.3AC-0.16BC-0.85A2-0.83B2-0.26C2

(4)

表3 蛋白質濃度回歸方程顯著性檢驗

等高線圖和曲面圖能夠直觀地反映出不同因素之間的交互作用及其對響應值的影響.由圖5可知,提取時間(A)與料液比(C)之間的交互作用對蛋白質提取率影響最大,其次是提取時間(A)與pH(B)的交互作用,而pH(B)與料液比(C)的交互作用最小.

圖5 因素交互作用等高線圖和曲面圖

2.3 酶解實驗

分別使胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶處于最適的酶解條件下酶解蛹蟲草蛋白.通過滴定液的消耗量判斷-NH2與甲醛結合釋放的H+的量,判斷對蛹蟲草蛋白水解效果最好的酶,三種蛋白酶消耗的滴定液的量如表4所示.由表可以看出,當三種蛋白酶均處于自身最適酶解條件時,堿性蛋白酶水解得到的蛹蟲草多肽溶液中-NH2與甲醛結合后釋放的H+的量最多,說明堿性蛋白酶對蛹蟲草蛋白水解效果相較于胃蛋白酶和木瓜蛋白酶效果更好,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解能力相當.因此選用堿性蛋白酶作為水解蛹蟲草蛋白的主要水解酶.

表4 甲醛滴定法測水解液中氨基氮含量

2.4 體外抗氧化實驗

2.4.1 總還原力變化

由圖6可知,酶解法制備的蛹蟲草多肽高、中、低濃度均具有一定的還原力,且還原力普遍高于同等濃度下的蛹蟲草粗蛋白.蛹蟲草多肽的還原力隨著濃度的升高而上升,具有明顯的濃度依附性.蛹蟲草粗蛋白的總還原性隨濃度變化不明顯.

圖6 蛹蟲草蛋白與蛹蟲草多肽還原力比較

2.4.2 DPPH清除率比較

由圖7 可知,蛹蟲草蛋白與其酶解多肽相比較,同等濃度下蛹蟲草多肽的DPPH清除率遠遠大于蛹蟲草蛋白質,是蛹蟲草蛋白的3～4倍.蛹蟲草多肽的DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而不斷增加.

圖7 蛹蟲草蛋白與蛹蟲草多肽DPPH清除率比較

2.4.3 羥自由基清除率

由圖8可知,酶解法制備的蛹蟲草多肽高、中、低濃度對羥自由基都有明顯的清除作用,且對-OH的清除率普遍高于同等濃度下的蛹蟲草粗蛋白.蛹蟲草-OH清除率隨著濃度的升高而上升,具有明顯的濃度依附性.

圖8 蛹蟲草蛋白與多肽羥自由基清除率比較

3 結論

研究結果表明,通過單因素實驗與響應面分析得到,堿提酸沉法提取蛹蟲草蛋白的最佳工藝為,提取時間144 min,最適酸堿度為pH 12.01,最適料液比為1∶19.通過單一酶水解法制備蛹蟲草多肽,使三種酶都處于其最適條件下進行反應,通過甲醛滴定法證明堿性蛋白酶為最適的蛹蟲草水解酶.通過體外抗氧化活性的測定,比較蛹蟲草蛋白及其酶解產物的活性變化,證明蛹蟲草蛋白酶解產物具備更好的體外抗氧化活性,為蛹蟲草蛋白的深加工以及生物活性肽的制備提供參考.