甜瓜蒂抗氧化、降糖活性及化學(xué)成分分析的研究

李 菡, 張光財(cái), 趙艷霞, 張欣雨

(1.陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院(生物與醫(yī)藥學(xué)院), 陜西 西安 710021; 2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 山東 濟(jì)南 250000)

0 引言

甜瓜蒂(PedicellusMelo)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材,取自于葫蘆科植物甜瓜(CucumismeloL)的干燥果柄,別名瓜蒂、瓜丁、苦丁香、甜瓜把[1],在中醫(yī)古籍中記錄其具有多種治療療效,如《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載其“主治大水,身面四肢浮腫……病在胸腹中,皆吐下之”,《金匱要略》中有“瓜蒂湯,治諸黃”,《千金翼方》中記載其“治熱病發(fā)黃”;《名醫(yī)別錄》中稱(chēng)其“去鼻中息肉,療黃疸”等[2].目前臨床上主要用于催吐和濕熱退黃治療,如將其研磨成細(xì)粉再經(jīng)鼻粘膜給藥或制成片劑口服給藥用于治療黃疸[3].將甜瓜蒂提取物進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明其對(duì)腫瘤細(xì)胞有顯著的抑制作用[4,5].自上世紀(jì)50年代在甜瓜蒂中發(fā)現(xiàn)葫蘆素成分以來(lái),甜瓜蒂受到越來(lái)越多的關(guān)注.現(xiàn)代藥學(xué)研究證實(shí)葫蘆素類(lèi)化合物是甜瓜蒂的主要活性物質(zhì),包括葫蘆素B、D、E,異葫蘆素B等,具有良好的抗炎、抗腫瘤活性、抗環(huán)境化學(xué)致癌物作用等藥理活性[6-9].甜瓜蒂藥用歷史悠久,目前關(guān)于甜瓜蒂中葫蘆素成分的提取純化和藥理學(xué)研究較多,但對(duì)其他活性成分以及藥理學(xué)機(jī)制探討較少,對(duì)甜瓜蒂提取物的分析缺乏.

非胰島素依賴(lài)型糖尿病患者占90%以上,由于胰島素分泌和(或)胰島素作用缺陷以及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝紊亂,常出現(xiàn)餐后血糖持續(xù)升高癥狀[10,11].持續(xù)性高血糖又會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)腎病、心血管疾病等并發(fā)癥[12],有效控制餐后高血糖是預(yù)防糖尿病、減少并發(fā)癥以及降低死亡率的重要措施之一.α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是引起餐后血糖升高的主要酶之一,抑制其活性已成為控制餐后高血糖的主要治療策略.此外,自由基是人體組織中許多生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物,在體內(nèi)堆積會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞,加速細(xì)胞衰老,導(dǎo)致惡性腫瘤、原發(fā)性高血壓、衰老、糖尿病等疾病[13,14].從天然產(chǎn)物中尋找活性組分,成為抗衰、降糖、降脂等功能性食品或藥物研究的熱點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)考察了甜瓜蒂提取物的化學(xué)成分,對(duì)提取物和萃取物進(jìn)行體外抗氧化和降糖活性研究,為甜瓜蒂在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的進(jìn)一步深入研究與利用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜瓜蒂,購(gòu)自安徽毫州藥材市場(chǎng),經(jīng)鑒定為葫蘆科植物甜瓜的干燥果蒂.將甜瓜蒂表面去除雜質(zhì),50 ℃鼓風(fēng)干燥 6 h,然后粉碎過(guò) 40 目篩,放入自封袋中備用.

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):上海源葉生物科技公司;抗壞血酸、鄰苯三酚、阿卡波糖、水楊酸、硫酸亞鐵:天津市天力化學(xué)試劑有限公司;鐵氰化鉀、三氯乙酸、碳酸鈉:天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;Tris-HCl:北京博奧拓達(dá)科技有限公司;α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside,PNPG):購(gòu)自于上海泰坦科技股份有限公司;無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(GZX-GF101-2-BS-Ⅱ/H),上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;電子天平(JA2603B),上海天美天平儀器有限公司;多功能粉碎機(jī)(BJ-500A),德清拜杰電器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4),金壇市江南儀器廠;臺(tái)式高速離心機(jī)(TG16-WS),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-5100),上海元析儀器有限公司;全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(varioskan flash),Q-Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀( Fisher Scientific),Heraeus Fresco 17離心機(jī)( Fisher Scientific),Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)(Dionex),賽默飛世爾科技有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

參照乙醇回流提取法[15]并做修改:稱(chēng)取甜瓜蒂粉末150 g,加入 10 倍體積的75%乙醇浸泡12 h,提取溫度為80 ℃,提取時(shí)間1.5 h,重復(fù)操作3次,合并濾液,減壓濃縮得到總提取物,干燥,稱(chēng)重,備用.將總提取物用50 mL蒸餾水重溶,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取,每種溶劑萃取3次,每次1.5 h,減壓濃縮得到石油醚組分,乙酸乙酯組分、正丁醇組分、水相組分,干燥,稱(chēng)重,備用.按照公式(1)計(jì)算總提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相五個(gè)組分得率:

(1)

1.3.2 UHPLC-Q-Exactive MS 分析

(1)色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH C18 column (100 mm*2.1 mm,1.7 μm, Waters,USA)進(jìn)行色譜分離,色譜柱柱溫為40 ℃,流速為0.3 mL/min,其中A 流動(dòng)相為水和0.1%甲酸,B 流動(dòng)相為乙腈.對(duì)代謝物采用以下梯度進(jìn)行洗脫:0～0.5 min,5%B;0.5～1.0 min,5%B;1.0～9.0 min,5%～100%B; 9.0～12.0 min,100%B;12.0～15.0 min,5%B.每個(gè)樣本的上樣體積為5 μL.整個(gè)分析過(guò)程中樣品置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中.為避免儀器檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)而造成的影響,采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析.樣本隊(duì)列每組樣品后插入QC樣品,用于監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性.

(2)Q-EXACTIVE 質(zhì)譜條件

分別采用電噴霧電離(ESI)正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè).樣品經(jīng)UHPLC分離后用Q-Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行質(zhì)譜分析.HILIC 色譜分離后的ESI源條件如下:Ion Source Gas1(Gas1):60,Ion Source Gas2(Gas2):60,Curtain gas (CUR):30,source temperature:320 ℃,IonSapary Voltage Floating (ISVF)±3500 V(正負(fù)兩種模式);MS scan m/z range:80～1200 Da,product ion scan resolution:17500, MS scan accumulation time 0.20 s/spectra,product ion scan accumulation time 0.05 s/spectra;二級(jí)質(zhì)譜采用information dependent acquisition (IDA)獲得,并且采用high sensitivity 模式,Declustering potential(DP):±60 V(正負(fù)兩種模式),Collision Energy :35±15 eV,IDA設(shè)置如下 Exclude isotopes within 4 Da,Candidate ions to monitor per cycle:6.

(3) 數(shù)據(jù)處理

將質(zhì)譜采集得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Compound Discoverer 3.0(Thermo Fisher Scientific)軟件進(jìn)行峰提取、峰對(duì)齊、峰校正、標(biāo)準(zhǔn)化等數(shù)據(jù)前處理.輸出由樣本名稱(chēng)、譜峰信息(包括保留時(shí)間和分子量)、及峰面積組成的三維數(shù)據(jù)矩陣.代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(<25 ppm)和二級(jí)譜圖匹配的方式,檢索實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫(kù)以及Bio cyc、HMDB、metlin,HFMDB、Lipidmaps等數(shù)據(jù)庫(kù).

(4)KEGG 通路富集分析

對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行基于京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,分析均根據(jù)P<0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

1.3.3 抗氧化能力測(cè)定

(1)DPPH 自由基清除能力測(cè)定

參照莊遠(yuǎn)杯等[16]方法并稍作修改,試管中加入樣品溶液0.2 mL,接著加入0.2 mL DPPH-乙醇溶液(0.2 mmol/L),渦旋儀混勻,暗處放置30 min,517 nm處測(cè)定OD值記為A1.用無(wú)水乙醇代替DPPH-乙醇溶液,測(cè)定OD值記為A2,并測(cè)定0.2 mL DPPH-乙醇溶液和0.2 mL無(wú)水乙醇混合液的OD值記為A0.以無(wú)水乙醇為參比,以抗壞血酸作為對(duì)照,DPPH自由基清除率按公式(2)計(jì)算:

DPPH 自由基清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100

(2)

(2)·OH清除能力測(cè)定

參照孫穎等[17]測(cè)定羥自由基的清除能力,試管中加入樣品溶液0.1 mL,再依次加入0.1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液,0.1 mL 6 mmol/L的過(guò)氧化氫溶液,1 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液,37 ℃水浴1 h,在510 nm處測(cè)定OD值記為A1.用蒸餾水代替樣品溶液測(cè)定OD值記為A0,用蒸餾水代替H2O2溶液測(cè)定OD值記為 A2,以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照,按照公式(3)計(jì)算·OH 清除率:

·OH自由基清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×10

(3)

(4)

(4)總還原力測(cè)定

參考張君萍等[19]的方法,準(zhǔn)確吸取 0.1 mL 樣品溶液置于試管中,依次加入0.25 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6,0.2 mol/L)和0.25 mL 1%鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴20 min,然后加入0.25 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng).3 000 r/min離心10 min,取上清液0.25 mL,加0.25 mL無(wú)水乙醇和0.05 mL 0.1% FeCl3溶液,渦旋儀振蕩,700 nm處測(cè)定OD值,平行測(cè)定3次,以抗壞血酸作為對(duì)照.OD值越大說(shuō)明樣品的總還原力越強(qiáng).

1.3.4 降糖能力測(cè)定[20]

(1) α-葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定

將磷酸鹽緩沖液配制成0.1 mol/L pH=6.8,取適量 PNPG溶于磷酸鹽緩沖液中配制成10 mmol/L,α-葡萄糖苷酶配置為10 U/mL,將上述溶液保存在適宜的條件下.配制0.312 5 mg/mL、0.625 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL 6個(gè)濃度的提取物和阿卡波糖樣品,陽(yáng)性對(duì)照為阿卡波糖.在96孔板中加入不同樣品溶液10 μL,40 μL的α-葡萄糖苷酶溶液,混勻后37 ℃恒溫水浴15 min,結(jié)束后加入50 μL的PNPG溶液,水浴反應(yīng)30 min,結(jié)束后加入100 μLNa2CO3終止反應(yīng),在405 nm處測(cè)其吸光值(A樣品).空白參比用蒸餾水代替樣品(A空白),對(duì)照以PBS代替α-葡萄糖苷酶(A對(duì)照),陽(yáng)性對(duì)照為阿卡波糖,按照公式(5)計(jì)算抑制率:

抑制率(%)=1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白×100

(5)

(2) α-淀粉酶抑制率的測(cè)定

配制0.312 5 mg/mL、0.625 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL 6個(gè)濃度的樣品溶液,陽(yáng)性對(duì)照為阿卡波糖且與樣品溶液同濃度.取1 mL的樣品溶液,1 mL的α-淀粉酶溶液,混勻后在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min,后加入2 mL 1%的淀粉酶溶液,于37 ℃反應(yīng)10 min后加入2 mL的DNS試劑,沸水浴5 min后,待其冷卻后,在540 nm處測(cè)其吸光值(A樣品).空白參比用磷酸鹽緩沖液代替樣品(A空白),對(duì)照以PBS代替α-淀粉酶(A對(duì)照),陽(yáng)性對(duì)照為阿卡波糖,按照公式(6)計(jì)算抑制率:

抑制率(%)=1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白×100

(6)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品組分得率

表1結(jié)果顯示,以150 g甜瓜蒂粉末進(jìn)行回流提取,提取物得率為38.72%,再將提取物進(jìn)行萃取,得到的各組分的質(zhì)量從大到小依次為水相、正丁醇相、石油醚相和乙酸乙酯相.

表1 樣品組分得率

2.2 UHPLC-Q-Exactive MS結(jié)果分析

2.2.1 分析鑒定結(jié)果

以甜瓜蒂總提取物為檢測(cè)對(duì)象(n=3),對(duì)UHPLC-Q-Exactive MS的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析,鑒定出35個(gè)單體化合物,主要以氨基酸、有機(jī)酸和萜類(lèi)化合物為主,將推測(cè)出的化合物名稱(chēng)、保留時(shí)間、化學(xué)式等列舉出來(lái),具體如表2所示.

表2 甜瓜蒂總提取物成分匯總表

2.2.2 KEGG通路分析

為了進(jìn)一步分析候選靶點(diǎn)的可能作用,將得到的代謝物提交到KEGG網(wǎng)站,進(jìn)行相關(guān)通路分析.如圖1所示,謝物主要富集在β-丙氨酸代謝,α-亞麻酸代謝,莨菪烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成,嘧啶代謝,嘌呤代謝,苯丙烷生物合成,泛酸和輔酶A生物合成,油菜素類(lèi)固醇生物合成,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和其他代謝途徑10條特定途徑.

圖1 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖2為KEGG通路富集分析柱狀圖.由圖2可以更清楚地看出,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,α-亞麻酸代謝,嘌呤代謝,β-丙氨酸代謝4條途徑均顯示出較低的P值(P<0.01),說(shuō)明這四條途徑顯著性差異明顯,其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的顯著性最為明顯.

圖2 KEGG通路富集分析柱狀圖

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH 自由基清除能力

如表3和圖3所示,樣品濃度為0.1 mg/mL～1.0 mg/mL 時(shí),隨著樣品濃度的升高,甜瓜蒂提取物及其萃取物對(duì) DPPH 自由基的清除率不斷地升高.經(jīng)計(jì)算,甜瓜蒂總提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相對(duì) DPPH 自由基清除能力的IC50值分別為 0.644 9 mg/mL、3.504 mg/mL、0.704 2 mg/mL、0.234 8 mg/mL、0.519 1 mg/mL.說(shuō)明甜瓜蒂提取物及其萃取物對(duì)DPPH 自由基有很強(qiáng)的清除能力,且正丁醇萃取物活性最好.

圖3 甜瓜蒂提取物及其不同極性部位對(duì)DPPH自由基清除率

表3 甜瓜蒂提取物及其不同極性部位對(duì)DPPH自由基清除效果

2.3.2 ·OH清除能力

如表4和圖4所示,濃度為 0.1 mg/mL～1.0 mg/mL時(shí),甜瓜蒂提取物及其萃取相對(duì)·OH的清除率呈劑量依賴(lài)性升高,趨勢(shì)明顯.濃度為1.0 mg/mL時(shí),抗壞血酸的·OH清除率為98.86%,五個(gè)組分的·OH清除率均在50%以上,效果最好的正丁醇萃取相的·OH清除率甚至達(dá)到了69.4%,說(shuō)明甜瓜蒂提取物及其不同極性部位對(duì)·OH有很強(qiáng)的清除能力,且正丁醇萃取相的清除能力最強(qiáng).

圖4 甜瓜蒂提取物及其不同極性部位對(duì)·OH自由基清除率

表4 甜瓜蒂提取物及其不同極性部位對(duì)·OH自由基清除效果

圖5 甜瓜蒂提取物及其不同極性部位對(duì)自由基清除率

表5 甜瓜蒂提取物及其不同極性部位對(duì)自由基清除效果

2.3.4 總還原力

如圖6所示,甜瓜蒂總提取物、水相、石油醚相和乙酸乙酯相總還原力趨近直線,但正丁醇相仍呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性趨勢(shì),表明甜瓜蒂正丁醇萃取物具有總還原能力.

圖6 甜瓜蒂提取物及其不同極性部位總還原力

2.4 降糖活性

2.4.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶是生物體糖代謝途徑中不可或缺的一種糖苷水解酶,可以通過(guò)抑制其活性來(lái)減少葡萄糖的生成和吸收,從而使機(jī)體胰腺水平保持正常.對(duì)甜瓜蒂提取物及其萃取物進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),其結(jié)果如圖7所示.當(dāng)樣品濃度在0.312 5～10 mg/mL時(shí),各組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率隨濃度的增大而增加,甜瓜蒂總提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相的IC50值分別為150.1 mg/mL、12.17 mg/mL、218.4 mg/mL、47.63 mg/mL、37.7 mg/mL,由此可見(jiàn)石油醚相對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制效果最好.

圖7 甜瓜蒂提取物及其不同極性部位α-葡萄糖苷酶抑制率

2.4.2 α-淀粉酶抑制活性

α-淀粉酶可以水解淀粉分子鏈中的α-1,4-葡萄糖苷鍵,將淀粉鏈切斷成為短鏈糊精、寡糖和少量麥芽糖和葡萄糖,通過(guò)抑制此酶的活性從而降低血糖和血脂水平.如圖8所示,甜瓜蒂提取物及其萃取物對(duì)α-淀粉酶抑制作用呈劑量依賴(lài)性,當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí),阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的抑制率為97.54%,總提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相五個(gè)組分的抑制率分別為69.35%、75%、71.06%、72.23%、63.38%.

圖8 甜瓜蒂提取物及其不同極性部位α-淀粉酶抑制率

經(jīng)計(jì)算,這五個(gè)組分的IC50值分別為3.012 mg/mL、1.452 mg/mL、1.839 mg/mL、4.167 mg/mL、1.493 mg/mL,可知在同條件下石油醚相萃取物對(duì)α-淀粉酶抑制率相對(duì)較好,數(shù)據(jù)表明甜瓜蒂提取物及其萃取物對(duì)α-淀粉酶有一定的抑制效果.

3 結(jié)論

來(lái)源于天然植物的活性藥物因其具有資源豐富、低毒高效、作用廣譜等優(yōu)勢(shì),近年來(lái)已經(jīng)發(fā)展成為糖尿病治療研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域,并且展現(xiàn)出良好的研究結(jié)果和應(yīng)用前景.本研究通過(guò)乙醇回流提取法制備傳統(tǒng)中藥甜瓜蒂提取物,再采用不同極性的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取,最終獲得甜瓜蒂總提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相五個(gè)組分.

對(duì)甜瓜蒂總提取物進(jìn)行UHPLC-Q-Exactive MS成分分析,共分析得到35個(gè)單體化合物,主要為氨基酸、有機(jī)酸和萜類(lèi)等化合物.將分析得到的代謝物進(jìn)行KEGG通路分析,共得到10條顯著的代謝途徑,其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的顯著性最為明顯.

對(duì)五個(gè)組分進(jìn)行體外抗氧化和降糖活性研究.體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明:在濃度0.1～1.0 mg/mL時(shí),甜瓜蒂提取物及其不同極性部位呈濃度依賴(lài)性,正丁醇相具有較強(qiáng)的還原能力,對(duì) DPPH 自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除能力的IC50值分別為0.234 8±0.053 mg/mL、0.148 5±0.027 mg/mL、0.037±0.007 mg/mL,體外抗氧化活性效果顯著.

同時(shí),五個(gè)組分表現(xiàn)出較好的體外降糖活性,其中石油醚相體外降糖效果最為明顯,對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力的IC50值分別為12.17±0.205 mg/mL、1.452±0.082 mg/mL,抑制效果僅次于陽(yáng)性藥物阿卡波糖.

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明甜瓜蒂提取物及其不同極性部位具有良好的體外抗氧化和降糖活性,尤其是正丁醇相和石油醚相,分別表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化和降糖能力,但這兩個(gè)萃取物成分尚不明確,且此次研究均為體外實(shí)驗(yàn),甜瓜蒂萃取物成分分析以及動(dòng)物體內(nèi)活性的驗(yàn)證,這些內(nèi)容有待進(jìn)一步的研究.