X連鎖隱性魚鱗病基因型表型分析

陸 鵬 陳 剛 崔夢醒 楊逸飛 梁 驁 黃鶴群 梁 波

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科,安徽合肥,230022;2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,安徽合肥,230022;3安徽醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,安徽合肥,230022

X連鎖隱性遺傳性魚鱗病(OMIM 308100,X-linked ichthyosis,XLI),也被稱為類固醇硫酸酯酶(steroid sulfatase,STS)缺乏癥,主要由STS催化功能缺失引發(fā)[1]。XLI是遺傳性魚鱗病的第二大常見形式,患病率僅次于尋常型魚鱗病,全球發(fā)病率為1∶1500至1∶6000[2],好發(fā)于男性(女性多為無癥狀攜帶者),癥狀常起始于新生兒或出生后不久[3]。典型的臨床表現(xiàn)為皮屑脫落,皮膚表面干燥,軀干部位及四肢多邊形褐色鱗片,病情常冬重夏輕。由于相近的臨床皮損,XLI可與尋常型魚鱗病、銀屑病、表皮松解性魚鱗病等脫屑性皮膚病相混淆,因而,容易發(fā)生誤診或漏診[4]。

本研究收集4例漢族XLI患者外周血及臨床信息,采用全外顯子組測序技術(shù)檢測基因突變情況,同時采用拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)分析及目標(biāo)區(qū)域瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。對FLG突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger 測序驗(yàn)證。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 4例漢族男性XLI病例為安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科門診就診患者。除皮膚表現(xiàn)外無其他器官異常。患者1來自安徽省,27歲,出生時眉弓上方及軀干輕微鱗屑,隨年齡增長皮損增加,皮損主要集中于腰部及四肢,可見褐色脫屑,患者有一舅舅有類似癥狀。患者2來自安徽省,41歲,出生后四肢干燥,后泛發(fā)全身,脛前伴有抓痕,患者有一外甥有類似癥狀。患者3來自河北省,31歲,出生后三個月腹部出現(xiàn)魚鱗樣脫屑,后逐漸向四肢蔓延,可見四肢干皮樣脫屑,患者曾被診斷為尋常型魚鱗病,家中有一舅舅有類似癥狀。患者4來自安徽省,18歲,出生后腳背有輕微脫屑,后泛發(fā)全身,冬季加重夏季緩解,現(xiàn)全身可見褐色多邊形鱗片樣皮損,并伴有黑褐色角化顆粒,病癥尤以膝關(guān)節(jié)和肘關(guān)節(jié)為重,該患者曾被診斷為表皮松解性魚鱗病,家族史不詳。患者1～3家系圖見圖1。患者臨床照片見圖2。

圖1 隱性X連鎖魚鱗病患者(1～3)家系圖,黑圓點(diǎn)為攜帶者,黑色方形為XLI患者

圖2 4例隱性X連鎖魚鱗病患者的臨床表現(xiàn),下肢可見褐色斑塊形魚鱗樣皮損(2a～2d分別對應(yīng)患者1～4)

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 本研究得到安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理會批準(zhǔn),并按照《赫爾辛基宣言》執(zhí)行,獲取入組4例患者簽署的知情同意書,然后填寫調(diào)查表信息并采集典型臨床照片,同時取4 mL外周靜脈血,采用FlexiGene DNA試劑盒(Qiagen,德國)抽提基因組DNA。

1.2.2 全外顯子組測序 構(gòu)建DNA文庫后用探針將全部外顯子區(qū)域富集,再將外顯子文庫進(jìn)行Illumina Hiseq2000平臺高通量測序。將測序得到的bcl文件用CASAVA1.8軟件轉(zhuǎn)換為fastq文件,再將全部測序讀長用BWA、Samtools和Picard軟件比對到人類參考基因組(版本為GRCh37/hg19)上,然后用GATK系列軟件將生成的bam文件進(jìn)行局部重新比對,去掉重復(fù)序列后利用其中的Haplotypecaller進(jìn)行變異檢測并導(dǎo)出vcf變異文件,最后用Annovar軟件對vcf變異文件進(jìn)行注釋。另外,通過計算各探針捕獲區(qū)域的相對平均測序深度分析CNV。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 根據(jù)STS基因參考序列設(shè)計引物,對患者及健康對照的STS基因外顯子進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。引物序列及擴(kuò)增條件見表1～3。

表1 STS基因2-11號外顯子PCR擴(kuò)增引物序列

表2 PCR體系

表3 PCR條件

1.2.4 突變分析及Sanger測序 突變通過人群頻率進(jìn)行篩選,查詢ClinVar數(shù)據(jù)庫突變的致病性,通過scsnv、revel、Func.refGene等工具搜尋可疑突變,分析拷貝數(shù)變異。

根據(jù)外顯子測序提示FLG突變位點(diǎn)c.5368C>T設(shè)計引物,上游引物:CGGGAGACATCAGACCTTTC,下游引物:CGAGGGTCCAGTGGTAGCCA,進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 STS基因檢測 CNV分析顯示患者STS基因的外顯子區(qū)域基本無讀長覆蓋(見圖3)。患者相對平均測序深度(relative average sequencing depth, RASD)在0.4～0.6的探針覆蓋區(qū)域標(biāo)記為藍(lán)色,相對平均測序深度小于0.1的探針覆蓋區(qū)域標(biāo)為紅色。和藍(lán)色區(qū)域相比,紅色區(qū)域的相對平均測序深度基本為0,這表明紅色區(qū)域缺失。患者母親CNV分析顯示,和藍(lán)色區(qū)域相比,紅色區(qū)域相對平均測序深度降低了大約一半,這表明紅色區(qū)域存在雜合缺失。

圖3 STS基因外顯子拷貝數(shù)變異分析(3a:患者:3b:患者母親)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示4例患者STS基因10個外顯子無相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物,健康對照擴(kuò)增出相應(yīng)大小擴(kuò)增片段。見圖4。

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖 S2-S11:患者;C2-C11:對照

2.2 FLG基因檢測 外顯子測序顯示患者1～3未發(fā)現(xiàn)FLG基因異常,4號患者攜帶一個已報道的FLG基因無義雜合突變:c.5368C>T(p.Gln1790Ter),在4號患者及健康對照中Sanger測序證實(shí)。見圖5。

5a:患者4雜合突變;5b:對照野生型圖5 FLG c.5368C>T突變Sanger測序圖

3 討論

遺傳性魚鱗病是一組先天性魚鱗病,病變不只局限于皮膚,其遺傳模式包括性連鎖隱性遺傳,常染色體顯性遺傳,常染色體半顯性遺傳,常染色體隱性遺傳等。XLI為常見遺傳性魚鱗病,除皮膚鱗屑外,也可累及身體其他系統(tǒng)和器官,如出現(xiàn)角膜混濁、智力障礙、隱睪等癥狀,危害較大[5]。本研究的4例患者僅表現(xiàn)皮膚癥狀,但表型明顯存在差異。其中,患者3癥狀輕微,主要表現(xiàn)為脛前鱗狀皮損,余部僅表現(xiàn)為干皮樣脫屑。患者4皮損嚴(yán)重程度最高,膝蓋和關(guān)節(jié)部位可見污垢樣皮損,全身均覆蓋有褐色多邊形皮損。XLI與其他脫屑性疾病有相似的臨床表現(xiàn),對于不典型的XLI患者,臨床上容易發(fā)生誤診或漏診,可能被診斷為尋常型魚鱗病或角化型魚鱗病。尤為值得注意的是,嚴(yán)重型尋常型魚鱗病和輕微型XLI的表型存在交叉重疊,僅根據(jù)患者的臨床特征難以做出準(zhǔn)確診斷。本研究4例患者,有2例曾被診斷為其他疾病。因此,對性連鎖隱性魚鱗病病史的采集至關(guān)重要,同時,基因檢測對可疑病例的確診不可或缺[6]。

全球范圍內(nèi),約90%XLI病例由STS基因完全缺失所致,少數(shù)患者可見STS基因部分缺失及點(diǎn)突變。納入本研究的4例患者均為STS基因完全缺失,與既往報道一致,這提示STS基因完全缺失可能也是我國XLI發(fā)病的主要原因。STS基因是循環(huán)膽固醇利用的關(guān)鍵基因,含有10個外顯子,編碼一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多通道膜蛋白。STS屬于硫酸酯酶家族,水解3-β-羥基類固醇硫酸鹽,作為雌激素,雄激素和膽固醇的代謝前提。STS功能的完整性與皮膚及其附屬器的發(fā)育和功能維持緊密相關(guān)。

此外,本研究中1例患者(患者4)出現(xiàn)FLG提前終止突變,c.5368C>T (p.Gln1790Ter)。該突變?yōu)橐阎蛔?曾在多個人群有過報道[7]。生物信息學(xué)工具SIFT及MutationTaster均預(yù)測突變效應(yīng)為“Damage”,提示為致病突變,人類孟德爾遺傳在線網(wǎng)站(OMIM)顯示該突變與特應(yīng)性皮炎及尋常型魚鱗病相關(guān)。gnomAD數(shù)據(jù)庫顯示c.5368C>T最小等位基因頻率為0.00004467,提示該突變在正常人群有一定的攜帶率。既往XLI患者隊列中進(jìn)行FLG突變研究主要在歐洲國家,丹麥的一項109例XLI患者隊列中,有66例患者做了FLG突變檢測,其中23例發(fā)現(xiàn)了FLG突變(34.85%)[4],德國和澳大利亞的一項51例XLI患者隊列中,FLG突變的患者是9例(17.6%)[8],我們的研究中4例患者中有1例出現(xiàn)FLG突變(25%),XLI患者中FLG突變的頻率顯著高于正常對照人群,這提示FLG突變可能也是漢族XLI患者中一個常見的修飾因子。FLG突變與XLI的臨床嚴(yán)重程度也存在關(guān)聯(lián),在蘇格蘭的一個家族中,同父異母的哥哥和弟弟都是XLI患者,哥哥伴有FLG突變(p.Arg501Ter),表現(xiàn)出了類似表皮松解性魚鱗病的更嚴(yán)重表型[9]。中國的一個XLS家系中STS和FLG突變(p.Ser1107SerfsTer15)的突變加重了IV表型,其他地區(qū)的病例也支持了STS和FLG突變的共同作用可能加重皮損表現(xiàn)的理論[10,11]。我們研究中,帶有FLG突變的患者表現(xiàn)出了更為嚴(yán)重的表型,膝關(guān)節(jié)有密集黑褐色角化顆粒,和既往報道結(jié)論一致。

從功能上來說,STS催化活性的缺失導(dǎo)致膽固醇硫酸鹽水解減少,從而積聚角質(zhì)層,影響角質(zhì)層脂類組分[12]。FLG基因提前終止突變導(dǎo)致編碼的絲聚蛋白的截短和蛋白功能的不完整性[13],進(jìn)而影響角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)組分,使得角質(zhì)層中的脂類組分和蛋白質(zhì)組分均發(fā)生變化,從而加重皮膚屏障的損害[14]。皮膚屏障受損使皮膚防御功能下降,引發(fā)感染和炎癥反應(yīng),從而進(jìn)一步加劇遺傳性魚鱗病的臨床表型[15]。

本研究擴(kuò)展了對患者的基因型和表型的認(rèn)識,FLG基因與XLI表型間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究闡明。