超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定肉類中15種唑類抗菌藥物

◎ 許慶鵬，吳雅芝，李 聰，綦 艷，酈明浩，李 皓，容培森

（廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東 佛山 528300）

我國作為畜牧業大國，近年養殖業發展突飛猛進，生產能力也顯著提高，在結構優化、產業升級等方面取得了一定的成就。在非洲豬瘟和其他動物源性疾病的影響下，一些生產企業、養殖戶等會采取相關的藥物治療和預防，使用或者過量使用一些高效但非法的藥物，例如，磺胺類、喹諾酮類、四環素類獸藥等[1-2]。唑類抗菌藥物同樣容易被濫用，該藥物不僅具有抗厭氧菌、廣譜、殺菌作用強，而且價格相對低廉，治療效果好，可用于防治球蟲病、豬出血性炎、滴蟲病等疾病。此外，此類藥物使用后可增加動物體重，大受養殖戶和生產企業的青睞[3-5]。然而，由于該類藥物對人體有危害，且濫用后容易產生耐藥性，一經食用后易造成食品安全事故，危害公共衛生安全[6-8]。在食品動物中，洛硝達唑和替硝唑被列為禁止使用的藥物，地美硝唑和甲硝唑可以作為治療用途，但不得在動物性食品中檢出[9-10]。

到目前為止，針對唑類抗菌藥物的檢測有很多，主要的研究多與可食性動物產品、動物相關組織和動物的排泄物等有關。檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法、氣相色譜法、有酶聯免疫法等[11-13]。其中，高效液相色譜法和氣相色譜法的檢測時間比質譜的檢測時間要長，需要有較高純度的樣品，且受雜質影響大。高效液相色譜-質譜聯用技術由于高分辨率，可以更加靈敏地檢測出目標物質，在現代儀器的更新迭代發展中逐漸成為一種炙手可熱的檢測手段。本研究主要針對肉類中唑類抗菌藥物殘留的測定方法，建立高效液相色譜質譜聯用方法，在確保肉類供給滿足的前提下，促進生產過程和銷售使用的質量安全，為相關監管職能部門提供強有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器與設備

SCIEX QTRAP 4500 超高效液相色譜-串聯質譜系統，美國 AB SCIEX 公司；Sigma 3-18K高速冷凍離心機；超聲波清洗機；漩渦混合器；去離子水發生器；氮氣濃縮儀。

1.1.2 材料與試劑

豬肉、魚肉，購于佛山市超市及農貿市場；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純試劑）；其他試劑均為分析純。甲硝唑、益康唑、奧硝唑、克霉唑、替硝唑、酮康唑、氟康唑、新康唑、咪康唑、異丙硝唑、苯硝咪唑、洛硝噠唑、氯甲硝咪唑、羥基甲硝唑、聯苯芐唑(純度≥98%），德國Ehrenstorfer公司。

1.2 標準溶液的配制

精確稱取15種唑類藥物標準品各10 mg于10 mL的棕色容量瓶中，用純乙腈溶解并定容，配制成各唑類藥物為1 mg/mL的單標標準儲備液，置于-18 ℃避光保存。再從上述15種單標標準儲備液中精確吸取0.1 mL于10 mL的棕色容量瓶中，用50%乙腈水溶液定容，配制成濃度為10 μg/mL的混合標準中間儲備液，并置于-18 ℃避光保存。以1%甲酸乙腈溶液為稀釋液，對混合標準中間儲備液進行稀釋，并配制成相應質量濃度范圍的標準系列溶液。采用同樣方法，得到基質混合標準系列工作溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

精確稱取2.00 g (精確至0.01 g) 搗碎后的組織樣品于50 mL的具塞離心管中，加入10 mL的1%甲酸乙腈溶液，置于渦旋器上渦旋混勻30 s，加入1 g NaCl和4 g NaSO4，振蕩1 min，充分溶解后，超聲10 min，然后移至高速冷凍離心機，于9 000 r/s離心3 min，取上清液5 mL于氮吹管中，使用氮氣濃縮儀于40 ℃吹干，加入1 mL的1%甲酸乙腈溶液溶解，經0.22 μm有機微孔濾膜過濾于進樣瓶中。待UPLCMS/MS測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters Acuity UPLC BEH C18反相色譜柱 (150 mm×1.0 mm, 1.7 μm) ；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；流速為0.25 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；運行時間10 min；梯度洗脫程序：0～2.0 min，90% A；2.0～5.0 min，90%～70% A；5.0～6.0 min，70%～40%A；6.0～7.5 min，40%A；7.5～8.0 min，40%～90%A；8.0～10.0 min，90%A。

1.3.3 質譜條件

電離方式：電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；掃描方式：多反應監測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；氣簾氣（CUR）：35 L/min（氮氣）；霧化氣（ GS1）：45 L/min；輔助氣（GS2）：45 L/min；離子源溫度（ TEM）：500 ℃。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理的優化

甲醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷和一些混合溶劑,通常用作化合物的提取劑，二氯甲烷和三氯甲烷具有一定毒性和危害性，因此一般不作為提取劑使用。唑類藥物及其代謝產物的極性較大，采用極性較強的甲醇和乙腈提取，提取效率較高。乙酸乙酯作為一種極性較低的提取劑，對于極性大的唑類藥物的提取效率偏低。提取劑在弱酸性下，能夠更好地破壞組織結構，使目標物游離出來，從而提高提取率。因此，本文采用甲醇、0.1%甲酸（V/V）甲醇、乙腈和0.1%甲酸（V/V）乙腈作為提取劑進行比較。不同的提取劑對目標物的提取存在一定的差異。經過實驗考察，甲醇和0.1%甲酸甲醇對15種唑類藥物的提取回收率低于60%，乙腈和0.1%甲酸乙腈的回收率可達75%。由于0.1%甲酸乙腈對15種唑類藥物有更好的分離效果，因此，選擇0.1%甲酸乙腈作為本實驗的提取劑。

2.2 色譜條件優化

本研究對反相色譜柱Waters Acuity UPLC BEH C18(150 mm×1.0 mm, 1.7 μm)和Waters Acuity UPLC HSS T3(150 mm×1.0 mm, 1.8 μm)，以及對將目標物質進行分離的流動相（乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-10 mmol乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸水）的效果進行了比較和評價。對流動相體系進行探究，在甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水流動相體系中，羥基甲硝唑和甲硝唑有比較明顯的拖尾，峰型差；在乙腈-10 mmol乙酸銨流動相體系中，基線噪音較大；在乙腈-水流動相體系中，15種目標化合物的分離度和響應值都有較好的效果，在乙腈-0.1%甲酸水流動相體系中，15種目標化合物的峰型對稱，分離度和響應度更好，最終以乙腈-0.1%甲酸水作為分離目標物質的流動相體系。考察比較不同色譜柱的分離效果，實驗表明，Waters Acuity UPLC BEH C18 (150 mm×1.0 mm,1.7 μm)能夠得到15種化合物峰型不拖尾，峰尖且對稱，分離效果好（如圖1）。

圖1 15種藥物的總離子流圖

2.3 質譜條件優化

將100 μg/L的15種混合標準溶液以流動注射的方式注入質譜儀中，考察正離子模式下15種唑類藥物的響應值，實驗結果表明，所有目標物在正離子模式下響應更好。通過一級質譜全掃描，分別確定15種藥物的母離子，在此基礎上，分別以母離子為研究目標，進行二級質譜掃描，確定了目標化合物對應的離子碎片，并在所有的離子碎片中選取目標藥物的定量離子和定性離子，即干擾小、離子豐度較高的兩個碎片離子，其中，離子豐度高的為定量離子。通過優化去簇電壓（DP）和碰撞電壓（CE），確定每個離子的最優去簇電壓和碰撞電壓。15種化合物的離子對參數見表1。

表1 15種化合物的質譜參數、線性關系、檢出限和定量限表

2.4 方法的線性關系和靈敏度

為消除基質效應的影響，本實驗以工作液為使用試劑配制基質標準曲線。如表1實驗結果所示，15種化合物在相應質量濃度范圍內呈現良好的線性關系，相關系數均大于0.995。將低濃度的標準溶液加入空白基質中，以信噪比(S/N)≥3時，作為本方法的檢出限(LOD)；以信噪比(S/N)≥10時，作為本方法的定量限(LOQ)。

2.5 回收率和精密度

以均質后的魚肉和豬肉為樣品基質，進行3水平6平行的加標回收實驗，進一步考察實驗的準確度和精密度，結果見表2。由表2可知，在不同的加標水平下，15種化合物在魚肉和豬肉中的平均回收率為76.4%～102.1%，相對標準偏差為0.2%～10.1%。

表2 魚肉和豬肉樣品中15種藥物的加標回收率和RSD表（n=6）

2.6 實際樣品檢測

本研究在佛山市各大超市和農貿市場購買了15份魚肉和15份豬肉進行檢測，在30批次的樣品中均未檢出15種抗菌類藥物殘留。

3 結論

本研究建立了針對肉類中甲硝唑、益康唑、奧硝唑等15種高風險唑類抗菌藥物的高效液相色譜串聯質譜測定方法，該方法簡單、有效、靈敏度高，可同時準確完成15種唑類抗菌藥物在肉類中的檢測。