北極甜蝦廢棄物多肽鉬螯合物的抗氧化性研究

◎ 劉雪凌，于 翠，亢 娜，林 貝，周莉莉

（燕京理工學院，河北 三河 065201）

微量金屬螯合物可以補充人體微量必需礦物質。現階段，市面上有無機鹽金屬礦物質補充劑、有機金屬礦物質補充劑、氨基酸（蛋白質或多肽）金屬礦物質補充劑等[1]。以北極甜蝦蝦殼為原料制備多肽鉬螯合物，可以在降低環境污染的同時，利用蝦殼生產高附加值產品，最大化利用蝦類廢棄物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北極甜蝦蝦殼，山東榮信水產食品集團股份有限公司提供；木瓜蛋白酶（800 μ/mg，生化試劑），山東卡貝因生物科技有限公司；無水乙醇（分析純），山東德彥化工有限公司；磷酸氫二鈉（分析純），廊坊市金海化工有限公司；三氧化鉬（分析純），天津市光復精細化工研究所；氫氧化鈉（分析純），天津市永大化學試劑有限公司；鹽酸羥胺（分析純），重慶市茂榮化工貿易有限公司；DPPH·（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）（分析純），北京百奧萊博科技有限公司；ABTS[2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]（分析純），酷爾化學科技有限公司；過硫酸鉀（分析純），河南銘之鑫化工產品有限公司；鄰二氮菲（分析純），隨州佳科生物工程有限公司；硫酸亞鐵（分析純），濟南裕景成林經貿有限公司。

1.2 儀器與設備

FA1004B電子分析天平，上海佑科儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥機，滄州晶碩試驗儀器有限公司；pH計，煙臺凱米斯儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DT5-6低速臺式離心機，北京時代北利離心機有限公司；UV-1601紫外分光光度計，北京北分瑞利分析儀器（集團）公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 北極甜蝦蝦殼多肽的制備

將提前烘干、粉碎的北極甜蝦蝦殼取適量，用無水乙醇脫色，過濾，濾渣用去離子水洗滌2～3次后，加入10%[酶的質量（mg）/溶劑體積（mL）]的木瓜蛋白酶溶液，在50 ℃、pH為4的條件下，制取蝦殼多肽。利用旋轉蒸發儀進行離心分離，取上清液放進烘箱進行烘干，即得蝦殼多肽[2]。

1.3.2 北極甜蝦蝦殼多肽鉬螯合物的制備

在蝦殼多肽中按照北極甜蝦蝦殼多肽與三氧化鉬質量比為1∶5，加入被氫氧化鈉溶解的三氧化鉬，螯合反應溫度為55 ℃，螯合反應pH為6，螯合反應時間為120 min。用90%以上的乙醇進行沉淀，靜置3 h，抽濾、干燥，即得北極甜蝦蝦殼多肽鉬螯合物[3]。

1.3.3 北極甜蝦蝦殼多肽鉬螯合物的抗氧化性研究

取適量北極甜蝦蝦殼多肽鉬螯合物，對DPPH·、ABTS、·OH 3種自由基進行清除效果實驗。整個研究探索了多肽鉬螯合物濃度、反應時間、反應溫度，對北極甜蝦蝦殼多肽鉬螯合物抗氧化性的影響[4]。

（1）對DPPH·清除率的計算

用C2H6O（AR）配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，陰暗處保存。將2.0 mL北極甜蝦蝦殼多肽溶液與2.0 mL該溶液混合。在強吸收波長處測吸光度（A1），空白組為2.0 mL無水乙醇加上2.0 mL的蒸餾水，測定其吸光度（A2），對照組為2.0 mL DPPH溶液加上2.0 mL的蒸餾水代替樣品，測定其吸光度（A3），用2 mL蒸餾水和2 mL無水乙醇混合做對照[5]。公式計算如下。

（2）對ABTS清除率的計算

將1滴北極甜蝦蝦殼多肽溶液與ABTS工作液均勻混合，在陰暗處靜置6 min。在734 nm波長處測吸光度，測定3次[5]。按以下公式進行清除率的計算。

式中，A0為不加樣品，加入ABTS的吸光度；Ai為北極甜蝦蝦殼多肽與ABTS反應的吸光度。

（3）對·OH清除率的計算

取鄰二氮菲溶液20滴至于試管中，依次加入緩沖液（pH為7.4）40滴、蒸餾水20滴、 硫酸亞鐵溶液10滴，充分搖勻，加 H2O24滴，溫度人體常溫即可,恒溫水浴鍋中45 min，于536 nm處測其吸光度，其值稱AD[7]。同前步，將其中用20滴蒸餾水代替H2O2測得的吸光度稱AB。再用試樣液1 mL代替第一步中的蒸餾水，測得的吸光度稱As。

·OH自由基清除率計算公式如下：

2 結果與討論

2.1 濃度對自由基清除率的影響

濃度對自由基清除率的影響見圖1。從圖1可以看出，不同多肽鉬螯合物濃度對3種自由基的清除率均有影響，隨著濃度的增加，對自由基的清除率也會增加。通過比較可知，多肽鉬螯合物清除ABTS所需濃度最低。

圖1 濃度對自由基清除率的影響圖

2.1.1 多肽鉬螯合物濃度對DPPH·清除率的影響

隨著多肽鉬螯合物的濃度增加，其與DPPH自由基的結合率越高，清除率逐漸上升，直至濃度達到6 mg/mL時，清除率幾乎保持不變，表明已將DPPH自由基全部消耗，說明抗氧化性隨著多肽鉬螯合物濃度的增加而增加，在6 mg/mL時達到飽和狀態。

2.1.2 多肽鉬螯合物濃度對ABTS清除率的影響

隨著多肽鉬螯合物濃度的增加,其清除率逐漸增加直至不變。在0.5 mg/mL濃度以下，由于反應的逐步進行，越來越多的ABTS自由基被多肽鉬螯合物還原，直至濃度高于0.5 mg/mL后，ABTS自由基全部被還原，清除率保持恒定，說明在0.5 mg/mL時反應已達到飽和狀態。

2.1.3 多肽鉬螯合物濃度對·OH清除率的影響

隨著多肽鉬螯合物濃度的增加，該清除能力不斷加強。當濃度為9 mg/mL時，對·OH清除效果最好，高達91.9%。

2.2 反應溫度對自由基清除率的影響

溫度對自由基清除率的影響見圖2。從圖2可以看出，不同溫度對3種自由基的清除率的影響規律相似，均是先升高后降低。通過比較可知，多肽鉬螯合物清除DPPH·所需最適溫度最低，其次是·OH，最后為ABTS。

圖2 反應溫度對自由基清除率的影響圖

2.2.1 多肽鉬螯合物反應溫度對DPPH·清除率的影響

圖2表明，清除率隨著溫度的增加而減小。導致清除率降低的原因可能是溫度升高引起多肽鉬螯合物結構改變，其多肽鏈越長該物質熱穩性越差。由圖2可見，此多肽鉬螯合物在5 ℃清除效果最好。

2.2.2 多肽鉬螯合物反應溫度對ABTS清除率的影響

隨著溫度升高，清除率不斷升高，40 ℃時達到清除率頂點值94.64%。40 ℃以后，清除率隨著溫度逐漸下跌，到50 ℃逐漸平穩。可知，溫度為40 ℃為此反應的最佳溫度。

2.2.3 多肽鉬螯合物反應溫度對·OH清除率的影響

當反應溫度增加時，對·OH清除率不斷攀升，30 ℃時，清除率達到最高點，高于30 ℃時，對·OH自由基的清除率逐步回跌。說明多肽鉬螯合物在30 ℃時對·OH清除效果最好。

2.3 反應時間對自由基清除率的影響

反應時間對自由基清除率的影響見圖3。從圖3可以看出，不同溫度對3種自由基的清除率的影響不同，對ABTS、·OH的清除率均是先升高后降低，而對于DPPH·的清除率則達到一定時間后趨于穩定。通過比較可知，多肽鉬螯合物清除ABTS所需時間最短。

圖3 反應時間對自由基清除率的影響圖

2.3.1 多肽鉬螯合物反應時間對DPPH·清除率的影響

多肽鉬螯合對DPPH·清除率隨著反應時間的增加而增加，在30 min后幾乎不變。因此，最佳清除反應時間為30 min。

2.3.2 多肽鉬螯合物反應時間對ABTS清除率的影響

隨著反應時間的增加，多肽鉬螯合物對ABTS自由基的清除率先增加后減小。反應5～10 min清除率達到穩定，為最佳反應時間。

2.3.3 多肽鉬螯合物反應時間對·OH清除率的影響

當0 min時，羥自由基（·OH）清除率不到1%，可知此反應很緩慢。清除率隨著時間推移而增高。40～50 min，羥自由基（·OH）清除率有所下降。反應時間為40 min時，對·OH的清除率為90.15%，為最大值。

3 結語

本研究利用北極甜蝦廢棄物進行多肽鉬螯合物的制備，通過對其抗氧化性的研究探索，得知北極甜蝦多肽鉬螯合物具有一定的抗氧化性，不同自由基等氧化物的抗氧化條件不同，其抗氧化能力不同。今后的抗氧化性研究，應該結合多肽鉬螯合物的制備工藝，不僅需要用螯合率作為比較指標，還需要增加抗氧化性指標，以提高該多肽鉬螯合物的應用價值。