泌尿生殖道支原體的實驗室檢測方法及其進展

覃元鋒

【摘要】? 近年來，由支原體引起的泌尿生殖道感染呈上升趨勢，且耐藥菌株逐年增加。如何快速、簡便、準確地對引起泌尿生殖道感染的主要病原體一泌尿生殖道支原體進行檢測，是臨床實驗室工作者的重要研究課題之一。本文對國內(nèi)泌尿生殖道支原體的實驗室檢測方法現(xiàn)狀作一綜述，為臨床實驗室選擇適合的泌尿生殖道支原體檢測方法提供參考，并期待更為簡便、快速和準確的檢測方法出現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】? 泌尿生殖道支原體；檢測方法；現(xiàn)狀；進展

中圖分類號：R446.5? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）13-0123-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.13.038

近年來，由支原體引起的泌尿生殖道感染呈上升趨勢，且由于國內(nèi)長期以來存在著抗生素不合理應(yīng)用現(xiàn)象，導(dǎo)致耐藥菌株逐年增加[1-2]。因此，如何快速、準確地檢測出泌尿生殖道支原體，為臨床提供鑒定及藥敏試驗結(jié)果是臨床檢驗微生物實驗室工作人員面臨的一個難題。本文就目前泌尿生殖道支原體的實驗室檢測方法綜述如下，為臨床實驗室選擇適合的檢測方法提供參考。

1? ? 支原體的概念及特點

支原體（mycoplasma）是一群介于細菌和病毒之間，有獨立的細胞結(jié)構(gòu)，但缺乏細胞壁而呈現(xiàn)出高度多形性的最小的一種原核細胞型微生物，常見的細胞形態(tài)為球形、球桿狀或絲狀，個體極為微小，大小一般低于1.0 μm。其能夠通過濾菌器，是目前所知道的能夠在人工培養(yǎng)基中生長繁殖的最小微生物，因其缺乏細胞壁的特性，導(dǎo)致針對細胞壁合成的青霉素等抗生素無效[3]。

支原體在自然界廣泛存在，是人體的常居菌群之一，即可以作為正常菌群寄居在人體內(nèi)，也可以引起人類的各種感染。目前已知的支原體共有80余種，但臨床上最常見的致病性支原體是解脲型支原體（ureaplasma uralyticum，Uu）、人型支原體（mycoplasma hominis，Mh）和生殖支原體（mycoplasma genitalium，Mg），三者合稱為泌尿生殖道支原體（MG），約占非淋性尿道炎的20%～30%[4]。自1980年首次從人體內(nèi)分離出泌尿生殖道支原體后，隨著研究和檢測方法的深入，由泌尿生殖道支原體引起的感染真實而廣泛地展現(xiàn)在人們面前[5]。

泌尿生殖道支原體不僅可引起男女性非特異性尿道炎、慢性前列腺炎、附睪炎和陰道炎等疾病，也是造成女性不孕不育和流產(chǎn)的重要原因之一[6-9]。據(jù)相關(guān)資料顯示，泌尿生殖道支原體的感染與不潔性行為有關(guān)[10-11]。

2? ? 支原體的直接染色和鏡檢

在較早的臨床檢驗中，一般是把臨床送檢的尿道拭子、陰道拭子、宮頸分泌物等標本直接進行涂片，待涂片晾干后按常規(guī)方式進行滅活固定，然后進行染色。常用的染色方法一般采用革蘭染色或Giemsa染色，但革蘭染色不易著色，常常導(dǎo)致在鏡下難以清晰地觀察到支原體；Giemsa染色呈現(xiàn)出紫藍色，在鏡下呈現(xiàn)出各種不規(guī)則的形態(tài)。

由于送檢的標本多為非無菌標本，混雜著人體組織碎片、人體分泌物和眾多的其他微生物等異物，導(dǎo)致鏡下難以分辨出支原體，從而極大地降低了陽性檢出率，特異性較差，無較大的檢測意義，因此只可以作為提示作用，現(xiàn)臨床實驗室已很少使用[12]。

隨著技術(shù)的發(fā)展，除了光學顯微鏡之外，電子顯微鏡、原子力顯微鏡、掃描顯微鏡等技術(shù)的出現(xiàn)極大地提高了分辨率水平。借助這些顯微鏡不僅能夠觀察到支原體的超微結(jié)構(gòu)，并且能夠直接觀察到支原體所致的機體組織病理改變情況，具有操作簡便、快速、需要標本量少、試驗耗材成本低等優(yōu)點，但由于這些顯微鏡價格昂貴，對操作者的技術(shù)水平要求較高，因此難以在臨床實驗室進行推廣。

3? ? ?分離培養(yǎng)法

3.1? ? 液體培養(yǎng)法? ? 液體培養(yǎng)法是WHO推薦使用的首選檢測方法[1]，該方法對日常培養(yǎng)環(huán)境要求不高，操作簡便，能夠同時獲得鑒定和藥敏試驗結(jié)果。其原理是泌尿生殖道支原體在生長過程中產(chǎn)生的尿素酶分解尿素或精氨酸產(chǎn)生堿，使培養(yǎng)基的pH值升高，進而導(dǎo)致培養(yǎng)基中酚紅指示劑變?yōu)榧t色來判斷培養(yǎng)結(jié)果。

由于液體培養(yǎng)法方便快速，且具有較高準確性等特點，自上世紀90年代法國梅里埃公司生產(chǎn)出了支原體IST檢測試劑盒后，國內(nèi)紛紛跟進，2000年左右已廣泛應(yīng)用于臨床，可于48 h內(nèi)獲得Uu和Mh的鑒定和藥敏試驗結(jié)果[3]，但該試劑盒未支持Mg的鑒定和藥敏試驗。值得一提的是：Uu可以形成生物膜，改變細胞膜的通透性，進而提高對抗生素的耐藥性[13-15]。由于臨床上常用的檢驗標本為宮頸分泌物或男性尿道分泌物，極易混雜有其他細菌，因此常常造成假陽性導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果偏高，這是目前難以解決的問題。

泌尿生殖道支原體由于細胞壁缺陷，天然耐受所有的β-內(nèi)酰胺類、磺胺類和利福平等抗生素，對大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素、紅霉素和克林霉素也因菌種的不同而呈現(xiàn)出不同的耐藥性[12]。

3.2? ? 固體培養(yǎng)法? ? 支原體對營養(yǎng)的要求較高，對低滲透壓敏感，除與常見細菌一樣需要基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)之外，還需要加入10%～20%的馬或小牛血清、酵母浸液、青霉素G和pH指示劑等。但馬鳳玲[16]報道在耐青霉素菌株存在的情況下，耐藥菌株可以無視培養(yǎng)基中青霉素G的抑制而大量繁殖，進而導(dǎo)致支原體培養(yǎng)的陽性率降低。

固體培養(yǎng)能夠在培養(yǎng)基上培養(yǎng)出支原體“油煎蛋”樣特征性的菌落，以及其獨特棕褐色顆粒菌落特征，培養(yǎng)結(jié)果直觀而準確，因此被視為泌尿生殖道支原體檢測方法的“金標準”。

在上世紀80年代，Tully等創(chuàng)建了SP-4培養(yǎng)基，首次從男性尿道分泌物中培養(yǎng)分離出生殖道支原體，為臨床實驗室提供了一種實用的生殖道支原體檢測方法[17-19]。后來Davies等在SP-4培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進行了一定程度的改良和優(yōu)化，促進生殖道支原體的生長，能夠在3 d左右獲得生殖道支原體菌落。由于Uu培養(yǎng)所需的pH值范圍為5.5～6.5，較其他生殖道支原體低，因此配制Uu培養(yǎng)基時應(yīng)注意，以免影響Uu的檢測陽性率[20]。

4? ? 免疫學檢測方法

支原體免疫學檢測方法在臨床實驗室中常用的有凝集反應(yīng)、補體結(jié)合試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等，雖然試驗方法眾多，但本質(zhì)上不是使用抗原檢測抗體，就是使用抗體檢測抗原，應(yīng)用最多的檢測方法是使用抗原檢測患者體內(nèi)存在的抗體。Taylor-Robinson等報道應(yīng)用間接MIF檢測非淋球菌性泌尿生殖道炎是一種具有高度敏感性、特異性，并且簡便易行的檢測方法[21]。Jensen等使用EIA檢測男性血液樣本中的MG抗體，但檢測效果不理想[22]。每一種試驗方法均有其特點和不同的針對性，例如代謝抑制試驗適用于Mh和Mg的檢測，但不適用于對Uu感染的檢測[2，23-24]。

由于人體正常寄居著口腔支原體、咽支原體等眾多的支原體，導(dǎo)致人體內(nèi)存在著不同強度的支原體抗體，而這些支原體抗體與Uu感染產(chǎn)生的抗體在目前科學技術(shù)下難以區(qū)分，且檢測的抗體均為定性檢測，未能進行定量檢測，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果缺乏特異性，在臨床上只存在指導(dǎo)性意義，無確診意義，有誤導(dǎo)臨床的可能[25]。

雖然免疫學檢測方法具有操作簡便、檢測時間短等優(yōu)點，但至今沒有適合的血清學檢驗方法能夠達到確診的效果。

5? ? 分子生物學方法

5.1? ? DNA探針技術(shù)? ? DNA探針技術(shù)是通過直接檢測病原體的特異性DNA從而判斷出病原體的存在與否。1988年人們使用該技術(shù)檢測男性患者尿道中的生殖道支原體獲得良好的效果，由于該技術(shù)具備省時、省力、有較高的敏感性和特異性，能夠解決免疫學檢測方法上難以區(qū)分交叉抗體的問題等優(yōu)點，使其迅速地在世界范圍內(nèi)推廣使用，也逐漸成為臨床實驗室的重要檢測手段之一[18]。

5.2? ? 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）由Mullis于1983年發(fā)明，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床實驗室。其工作原理類似于DNA的天然復(fù)制，通過對處理過的標本進行變性—退火—延伸等擴增，能夠在較短的時間內(nèi)將靶核酸擴增放大幾百萬倍，進而檢測出特定的檢測目標。

PCR檢測技術(shù)是目前臨床上公認的檢測支原體的最佳方法，靈敏度和特異性均較高，而且具有快速、簡便等特點[12，26]，但對標本的要求較高，容易受到污染的影響導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性，這是目前需要解決的難題之一。歐洲[27]和英國[28]推薦男性采用首段尿液進行檢測，與我國臨床實驗室常用的男性尿道拭子不同，兩種標本的準確性和特異性對比目前國內(nèi)報道還是不多。英國[29]推薦女性標本采用陰道拭子，但國內(nèi)使用宮頸拭子居多。

基于PCR技術(shù)發(fā)展起來的FQ-PCR、SAT、LAMP和RDB等檢測技術(shù)，除了具備原PCR技術(shù)的特點之外，還具有一定的創(chuàng)新性，也逐漸成為實驗室檢驗的重要技術(shù)[12]。尤為值得一提的是LAMP，該技術(shù)是采用基因擴增與免疫層析技術(shù)相結(jié)合建立起來的一種Uu檢測方法，除具備PCR技術(shù)的優(yōu)點，該技術(shù)還不需要昂貴的特殊儀器，且試劑價格更為低廉，適用于廣大基層醫(yī)院開展[1]。

6? ? 質(zhì)譜儀檢測技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF MS）是近年發(fā)展起來的一種檢測方法，可以對培養(yǎng)出來的菌落進行快速鑒定，結(jié)果準確可靠，操作簡便，成本較低，雖然目前在檢測支原體耐藥性方面對藥物檢測的種類有限，但隨著技術(shù)的發(fā)展和質(zhì)譜儀的普及，其必然成為臨床實驗室檢測泌尿生殖道支原體的常用方法[29]。

由泌尿生殖道支原體引起的感染在臨床表現(xiàn)上缺乏特異性，因此其診斷依賴于臨床實驗室檢驗結(jié)果。目前國內(nèi)檢測泌尿生殖道支原體的試驗方法眾多，但培養(yǎng)法是公認的金標準，而由于培養(yǎng)的困難性，臨床上應(yīng)用最多的還是商品化的支原體鑒定、藥敏試劑盒。在已經(jīng)建立了PCR實驗室的醫(yī)院基本上都開展了泌尿生殖道支原體檢測，但每種檢驗方法均存在著一定的不足，期待更為快速、簡便和準確的檢驗方法出現(xiàn)。

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（收稿日期：2023-02-23）