原發性膽汁性膽管炎患者血清IL-35和PGRN表達水平及其臨床意義*

馬 琴,向 瑜,鄒 麟,陳 瀑

(重慶醫科大學附屬第一醫院檢驗科,重慶 400016)

原發性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis,PBC)是最常見的自身免疫性肝病(autoimmune liver disease,AILD)。該病為自身免疫介導的慢性肝膽炎性病變,以膽道破壞和進行性肝內膽汁淤積為病變特征。抗線粒體抗體出現,以及肝功能標志物堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰胺轉移酶(GGT)和免疫球蛋白M升高是其血清學特征[1-2]。PBC的發病機制尚不清楚,目前研究認為PBC發病可能是遺傳和環境因素相互作用的結果,其中免疫調節起著至關重要的作用,而細胞因子是免疫系統的重要組成部分,參與了PBC的發病。顆粒蛋白前體(progranulin,PGRN)是一種由顆粒蛋白基因編碼的多功能分泌型糖蛋白,它在免疫細胞、增殖的上皮細胞[3]、軟骨細胞和神經元[4]中大量表達,具有調節免疫炎癥反應和促進生長發育的作用。近年來,大量研究證實了PGRN作為免疫調節劑的重要性。在類風濕關節炎、炎癥性腸病等多種自身免疫性疾病的發展中,PGRN通過調節免疫功能促進疾病進展,特別是通過調節腫瘤壞死因子-α/TNF受體(TNF-α/TNFR)信號通路[5]。同時,PGRN裂解形成的顆粒體蛋白(granulin,GRN)小肽片段中和其抗炎作用,刺激機體產生多種炎癥因子,增強免疫反應,促進自身免疫性疾病的發生[5]。但PGRN與PBC在臨床癥狀和實驗室指標上的關系尚缺乏報道。因此,研究PGRN是否參與調節PBC中的炎癥反應具有一定意義,可以為PGRN和PBC之間的關系提供新的見解。

白細胞介素(interleukin,IL)-35是最近發現的IL-12因子家族成員。它是一種主要由調節性T淋巴細胞(Treg)和調節性B細胞(Breg)[6]合成的細胞因子,通過抑制T淋巴細胞增殖發揮免疫抑制功能,同時誘導Treg生成,提高Treg比例,增加抗炎細胞因子,抑制免疫細胞增殖,保護肝臟免受炎癥環境的攻擊,發揮免疫抑制作用[7]。目前,IL-35已被證實與幾種自身免疫性疾病的發生和進展密切相關,包括炎癥性腸病、系統性硬化癥、類風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡[8]。有研究報道,PBC患者血清IL-35水平較低[9]。因此,IL-35可能在血清和肝臟組織中作為疾病的保護因子影響PBC的發生和進展。但關于IL-35在PBC中的免疫應答機制及其與疾病發生、發展的關系仍在探索中。本研究通過檢測PBC患者血清PGRN和IL-35水平,分析其與臨床癥狀、實驗室指標、疾病活動性和療效的關系,探討PGRN和IL-35在PBC發展中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年12月至2022年3月在本院確診為PBC的住院和門診患者58例(PBC組)作為研究對象,所有患者均符合亞太肝臟研究學會(APASL)臨床實踐指南2022年制定的PBC診斷標準[10]。排除標準:(1)合并其他肝炎病毒及人類免疫缺陷病毒感染;(2)有任何自身免疫性疾病史;(3)酒精或藥物引起的肝損傷等;(4)近期使用糖皮質激素或免疫抑制劑治療。根據肝功能指標分為異常肝功能組(47例)和正常肝功能組(11例)兩個亞組,肝功能指標包括血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、GGT、ALP,其中1項及以上高于實驗室正常參考范圍上限判為肝功能異常。所有患者中26例采用熊去氧膽酸(UDCA)標準治療方案,并在治療4周后得到隨訪。選取同期在本院健康檢查中心招募的26例健康體檢者作為健康對照組(HC組)。本研究獲得重慶醫科大學倫理委員會批準(批準號:2022-K78)。

1.2 方法

1.2.1臨床和實驗室資料收集

所有臨床資料均來自門診和住院病歷,所有患者在入院時進行病史記錄。(1)一般臨床資料:包括性別、年齡、體重指數(BMI);(2)實驗室檢查指標:臨床相關實驗室檢查均在本院檢驗科完成,其中血清總蛋白、白蛋白、總膽紅素、直接膽紅素、ALT、AST、GGT、ALP采用德國羅氏公司Cobas C701全自動生化分析儀及配套試劑檢測;(3)癥狀和影像學表現:包括乏力、瘙癢、腹脹、黃疸等癥狀,以及肝硬化、門靜脈高壓、腹水、膽囊壁增厚等影像學表現。

1.2.2血清標本的收集和處理

所有研究對象在空腹6～8 h后采集靜脈血,3 600 r/min離心10 min后進行實驗室生化指標檢測,同時用EP管收集血清,于-80 ℃冰箱儲存,避免反復凍融。

1.2.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IL-35和PGRN水平

采用ELISA測定血清IL-35和PGRN水平,IL-35 ELISA試劑盒購自美國Novus公司,PGRN ELISA試劑盒購自美國R&D公司,操作參照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 PBC組與HC組臨床和實驗室指標比較

PBC組血清白蛋白水平明顯低于HC組(P<0.001),總膽紅素、ALT、AST、GGT及ALP水平均明顯高于HC組(P<0.05),兩組性別、年齡、BMI及其他實驗室指標水平均無明顯差異(P>0.05),見表1。

表1 PBC組與HC組臨床和實驗室指標比較

2.2 PBC組與HC組血清PGRN和IL-35水平比較

PBC組血清PGRN水平為100.33(86.96,126.66)ng/mL,高于HC組的54.92(48.56,68.77)ng/mL,差異有統計學意義(P<0.001);PBC組和HC組血清IL-35水平分別為6.31(0.00,32.39)、11.14(4.33,14.03)pg/mL,差異無統計學意義(P>0.05),見圖1。

A:血清PGRN水平比較;B:血清IL-35水平比較;a:P<0.001。圖1 PBC組與HC組血清PGRN和IL-35水平比較

2.3 PGRN、IL-35水平與肝功能的關系

PBC患者中異常肝功能組和正常肝功能組血清PGRN水平分別為101.77(86.38,127.98)和91.59(87.16,114.47)ng/mL,均明顯高于HC組(P<0.001);正常肝功能組和異常肝功能組血清PGRN水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。正常肝功能組和異常肝功能組血清IL-35水平分別為42.87(29.67,69.93)和0.00(0.00,14.87)pg/mL,差異有統計學意義(P<0.001),見圖2。

A:血清PGRN水平比較;B:血清IL-35水平比較;a:P<0.001。圖2 不同肝功能情況PBC患者及健康對照者血清PGRN和IL-35水平比較

2.4 PBC治療前后血清PGRN和IL-35水平比較

26例PBC患者治療前、后血清PGRN水平分別為108.02(89.82,139.20)和83.93(67.00,108.47)ng/mL,治療后較治療前明顯降低(P<0.05);治療前、后血清IL-35水平分別為0.00(0.00,15.43)和10.29(0.00,24.25)pg/mL,差異無統計學意義(P>0.05),見圖3。

A:血清PGRN水平比較;B:血清IL-35水平比較;b:P<0.05。圖3 PBC患者治療前后血清PGRN和IL-35水平比較

2.5 不同癥狀和影像學表現患者血清PGRN、IL-35水平的差異

58例PBC患者中,有肝硬化影像學表現的患者血清PGRN水平明顯高于無肝硬化影像學表現的患者(P<0.001);有瘙癢癥狀的患者血清IL-35水平明顯低于無瘙癢癥狀的患者(P=0.007),其余不同癥狀和影像學表現的患者血清PGRN、IL-35水平均無明顯差異(P>0.05),見表2、3。

表2 不同癥狀和影像學表現患者血清PGRN水平比較[n=58,M(Q1,Q3),ng/mL]

表3 不同癥狀和影像學表現患者血清IL-35水平比較[n=58,M(Q1,Q3),pg/mL]

3 討 論

PBC在全球范圍內廣泛分布,既往報道主要來自歐洲和北美,但近年來亞太地區發病率呈上升趨勢。PBC的病因和發病機制尚未完全明確。有研究顯示,PBC患者體內存在明顯的免疫調節紊亂及多種細胞因子的異常表達,且與PBC的發生和發展、嚴重程度及預后密切相關[11-13]。目前,PGRN和IL-35在自身免疫性疾病中的作用已經成為研究熱點,但在PBC中的研究少見報道。本研究檢測了PBC患者血清PGRN和IL-35水平,并分析其與疾病的關系。

PGRN是一種自分泌生長因子,在傷口愈合、腫瘤發生和發展、感染及細胞增殖等過程中發揮調節作用[14]。另有研究表明,PGRN是一種多功能免疫調節分子,可調節免疫細胞的募集,以及趨化因子和炎癥因子的釋放,如通過調節IL-8、IL-10、TNF-α等炎癥因子的分泌控制機體的免疫反應[15-16]。PGRN通過促進自身抗體的產生,增強輔助性T淋巴細胞(Th)1和Th17的細胞反應,以及促進Treg的產生[17-18],參與多種自身免疫性疾病的發生、發展。近期有研究表明,PGRN與Treg上的TNFR2結合,拮抗TNF-α下調Treg的免疫抑制功能,保護Treg的正常功能,從而控制自身免疫反應[19]。如PGRN在類風濕關節炎中的表達水平與疾病活動度及關節功能密切相關[15]。在系統性紅斑狼瘡中PGRN表達明顯升高,且與疾病活性呈正相關,其可通過增強Toll樣受體9(TLR9)信號,促進炎癥反應,從而加重疾病嚴重程度[20]。本研究與以上研究結果一致,PBC患者血清PGRN水平明顯高于健康對照者,表明PBC患者較健康人群機體表現出較強的免疫炎癥反應。進一步分析發現,正常肝功能和異常肝功能PBC患者血清PGRN水平無明顯差異,但有肝硬化的PBC患者血清PGRN水平明顯高于無肝硬化患者,提示PGRN可作為判斷PBC患者肝硬化的一項重要指標。此外,UDCA治療4周后,PBC患者血清PGRN水平較治療前明顯降低,提示PGRN可能作為PBC的療效觀察指標。

IL-35作為一種新的具有免疫抑制功能的細胞因子,主要通過提高Treg比例,分泌更多的炎癥細胞因子,抑制Th17分化來發揮免疫調節作用[21-23]。WANG 等[24]研究表明,IL-35可以通過調節炎癥性腸病小鼠模型炎癥因子的表達,促進炎癥因子IL-10的分泌,抑制促炎細胞因子IL-6、TNF-α、IL-17等的表達,發揮免疫抑制作用。在一項關于系統性紅斑狼瘡的研究中發現,活動期系統性紅斑狼瘡患者血清IL-35水平低于非活動期,狼瘡性腎炎患者血清IL-35水平低于無狼瘡性腎炎患者[25]。據LI等[9]報道,PBC患者血清IL-35水平低于健康人群,且晚期患者血清IL-35水平高于早期患者。另有研究發現,IL-35在慢性乙型肝炎患者血清中呈高表達,而在健康對照組中沒有檢測到IL-35[26]。這些研究結果均提示IL-35的生物學功能較為復雜,在不同的疾病中其產生機制及調控免疫反應的作用不盡相同。本研究在大多數PBC患者和健康對照者血清中都檢測到IL-35,但IL-35總體水平較低,且PBC患者與健康對照者無明顯差異,這與LI等[9]發現PBC患者血清IL-35水平低于健康對照組不一致,分析原因可能與納入人群、樣本量、患者的疾病進程不同等因素有關。比較不同肝功能狀態的PBC患者血清IL-35水平發現,正常肝功能PBC患者血清IL-35水平明顯高于異常肝功能PBC患者和健康對照者,這似乎與IL-35的免疫負調節功能相矛盾,分析原因可能是由于在疾病發生和發展的某些時機機體處于“免疫麻痹”狀態,導致IL-35的促炎-抗炎功能出現不平衡現象,抗炎因子的表達占據優勢,機體產生更多的IL-35來拮抗促炎性細胞因子以維持肝功能的穩定。本研究提示了PBC患者血清IL-35水平與疾病活動度相關的可能性。但在治療前后的觀察中發現血清IL-35水平無明顯變化,表明IL-35可能與療效無關。此外,在分析其與臨床癥狀的關系中發現,有瘙癢癥狀的PBC患者血清IL-35水平更低,而瘙癢是膽汁淤積的一個重要臨床表現,也是PBC的疾病特點。鑒于IL-35在PBC患者體內較為復雜的表現,還需進一步研究分析其在疾病中的作用。

綜上所述,血清PGRN和IL-35在PBC的發生、發展中呈現出不同的變化,并與疾病的活動性和療效有一定的關系,可能作為新的血清學指標輔助疾病診療。但本研究存在樣本量較小、未進行疾病分期等不足,需進行更深入的研究來闡明PGRN和IL-35在PBC發生、發展中的復雜機制。