細胞角蛋白19片段21-1、轉移相關基因1、切除修復交叉互補基因1在肺癌中的應用價值

張 杰,劉永昌,劉 浩

(山東省煙臺市煙臺山醫院,山東 煙臺 264001)

肺癌是全球面臨的重大公共衛生問題,具有較高死亡率,患者預后較差,根據世界衛生組織的預測,中國2025年肺癌死亡人數將達到100萬[1]。肺癌中,有八成及以上為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。研究發現[2],NSCLC發生、發展機制涉及多種基因改變。轉移相關基因1(metastasis-associated gene 1, MTA1)通過信號轉導,調控一系列與浸潤轉移相關的蛋白,參與多種惡性腫瘤的發展及侵襲過程[3]。切除修復交叉互補基因1(ERCC1)具有核苷酸切除修復功能,參與脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)損傷識別及DNA鏈切割過程,惡性腫瘤增殖引起DNA損傷,ERCC1表達隨之升高[4]。細胞角蛋白19片段21-1(cytokeratin 19 fragments antigen 21-1, CYFRA21-1)作為細胞骨架成分,參與腫瘤細胞異常分裂過程,在正常組織或良性腫瘤組織中幾乎不表達,但在上皮組織來源的惡性腫瘤細胞中表達顯著升高[5]。本研究分析CYFRA21-1、MTA1、ERCC1檢測在肺癌患者術前分期及淋巴結轉移中的評估價值,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2019年1月至2021年12月我院96例NSCLC患者臨床資料。納入標準:①行擇期胸腔鏡肺癌根治術,經病理檢查確診;②符合美國國家癌癥網絡2018年發布的第5版臨床實踐指南NSCLC診療標準[6];③病理標本、病歷數據完整。排除標準:①根治術前行抗腫瘤治療;②根治術前存在急慢性感染;③非原發性NSCLC或合并肝細胞癌等其他惡性腫瘤;④合并強直性脊柱炎等免疫系統疾病;⑤伴心、腎等主要臟器功能不全。

1.2 方法取術中切除的NSCLC患者癌組織及距手術切緣>2 cm的癌旁組織,固定液使用pH 7.4的10%福爾馬林,常規制作石蠟切片(4 μm);采用EnVision兩步法(免疫組化)檢測CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達情況,常規脫蠟、梯度水化,微波修復3次,10 min/次,3%過氧化氫中封閉內源過氧化物10 min;分別滴加一抗兔抗人CYFRA21-1多克隆抗體(上海圻明生物科技,稀釋濃度1∶1000)、鼠抗人MTA1單克隆抗體(中國中杉金橋,1∶150)、鼠抗人ERCC-1單克隆抗體(英國Abcam,1∶50),低溫孵育12 h(4 ℃),滴加二抗(丹麥Dako,EnVisionTM試劑盒,生物素標記),室溫孵育40 min,使用德國Sigma-Aldrich公司的二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine, DAB)顯色90 s,并使用該公司生產的蘇木精復染,梯度酒精脫水(無水乙醇至70%乙醇,30 s/梯度),常規透明、封片。使用雙盲法(由兩名工作年限≥5年的病理醫師完成)閱片,高倍鏡(×200)下隨機觀察5次,每次計數100個細胞,以陽性細胞比率+染色強度評估表達強度[7],陽性細胞比率分別計分0分(<10%)、1分(10%～30%)、2分(31%～50%)、3分(51%～75%)、4分(>75%);染色強度分別計分0分(無色)、1分(淡黃)、2分(棕黃)、3分(棕褐),2項相加的總分≥3分即為表達陽性,表達強度根據總分判斷,3分為+,4～5分為++,6～7分為+++。

1.3 觀察指標①NSCLC癌組織與癌旁組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達情況;②NSCLC不同臨床病理特征者癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達情況;③NSCLC癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達強度與病理特征的關聯性分析。

1.4 統計學方法采用SPSS 23.0軟件分析數據。計數資料以例數(%)表示,組間比較采用χ2檢驗;等級資料比較采用秩和檢驗;相關性分析采用Spearman秩相關分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 不同組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達情況癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達陽性率均高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織與癌旁組織表達陽性率比較 [n(%)]

2.2 不同臨床病理特征者癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達陽性率比較淋巴結轉移者癌組織MTA1、ERCC-1陽性率高于未淋巴結轉移者(χ2=8.118、5.674,P<0.05),TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期者(χ2=9.192、4.358、8.802,P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征者表達陽性率比較 [n(%)]

2.3 癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達與NSCLC臨床病理特征的關聯性分析淋巴結轉移者癌組織MTA1、ERCC-1表達強度顯著高于未淋巴結轉移者(Z=3.590、2.560,P<0.05),TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達強度顯著高于Ⅰ～Ⅱ期者(Z=3.424、2.484、3.163,P<0.05)。見表3。Spearman秩相關分析顯示,NSCLC淋巴結轉移與癌組織MTA1、ERCC-1表達強度呈正相關(r=0.496、0.442,P<0.001),TNM分期與癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達強度呈正相關(r=0.690、0.558、0.594,P<0.001)。

表3 淋巴結轉移、TNM分期不同者癌組織中CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達強度比較 [n(%)]

3 討論

MTA1基因在人染色體的定位由Nawa等經熒光原位雜交法發現,其位于14q32.3,且其互補DNA編碼蛋白包含獨立閱讀開放框,為其基因轉錄的調節作用奠定基礎,MTA1蛋白定位于細胞核內,無跨膜或膜相關功能,近年研究顯示[8],MTA1蛋白異常表達在多種惡性腫瘤中可見。楊昕等[9]研究發現,MTA1在NSCLC患者中的表達率為79.07%,且MTA1高表達者預后不良風險更高。還有研究指出[10],MTA1高表達可能對血管內皮生長因子的表達有上調作用,從而加速腫瘤血管生成,為腫瘤細胞的侵襲及轉移創造良好環境,下調MTA1的表達,可抑制腫瘤進展。本研究中,NSCLC患者癌組織MTA1表達陽性率明顯高于癌旁組織,提示MTA1表達升高可能參與NSCLC的發生、發展。不僅如此,淋巴結轉移及TNM高分期者癌組織MTA1陽性率及表達強度更高,且淋巴結轉移及TNM分期與均MTA1表達強度呈正顯著相關,提示MTA1的表達上調可能參與了NSCLC的侵襲及轉移。然而,MTA1促進惡性腫瘤增殖的具體作用機制尚未闡明,本研究結果僅表明MTA1可能是NSCLC治療的新靶點,還需后續基于分子生物學對其作用機制作進一步探究。

ERCC-1為DNA損傷修復基因,ERCC-1基因敲除的小鼠表現為細胞周期停滯、細胞,且由于是高度單鏈DNA核酸內切酶,在表達出特定蛋白時才具有DNA損傷修復功能,近年研究發現[11],ERCC-1表達異常與肺癌的發生有關。另外,ERCC-1基因被發現與鉑類藥物耐藥機制密切相關,因ERCC-1可參與核苷酸切除修復,鉑類化療藥物引起DNA損傷后,ERCC-1高表達者可迅速修復細胞分裂周期中的DNA損傷,導致化療無效,即引起鉑類藥物耐藥,故檢測ERCC-1的表達水平對指導臨床化療具有重要意義[12]。本研究中,相較于癌旁組織,癌組織ERCC-1表達陽性率明顯升高,且其表達強度與淋巴結轉移及TNM分期呈明顯正相關,考慮與NSCLC腫瘤細胞大量增殖、轉移時,可引起更多的細胞DNA損傷,機體ERCC-1表達隨之上調有關。

CYFRA21-1作為細胞重要的骨架蛋白,其表達異常可增加細胞異型性,促進腫瘤向周圍鄰近組織侵襲,甚至轉移[13]。Cheng等[14]指出,CYFRA21-1可參與肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發生,其血清檢測目前常用于惡性腫瘤的早篩。本研究中,癌組織CYFRA21-1表達陽性率較癌旁組織明顯升高,其表達強度與NSCLC臨床分期呈明顯正相關,與分化程度、淋巴結轉移情況等無明顯關聯性,與目前研究發現有所不同[15]。該結果一方面與本研究納入樣本量不足,導致檢驗效能偏低有關;另一方面,NSCLC腫瘤細胞的惡性與侵襲能力與多種基因表達有關,單一CYFRA21-1的表達情況不能全面評估其侵襲能力,故其與淋巴結轉移的相關性較差。

綜上所述,CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1可能均參與了NSCLC的發生、發展,檢測三者的癌組織表達水平對判斷NSCLC侵襲及轉移能力有積極作用,可指導臨床治療。