人釉原蛋白在不同pH值下體外自組裝及礦化能力的研究

鐘 秀,田 鯤

(1.西藏自治區人民政府駐成都辦事處醫院口腔科,四川 成都 610041;2.西南醫科大學口腔醫學院,四川 瀘州 646000;3.四川省醫學科學院·四川省人民醫院口腔科,四川 成都 610072)

釉基質蛋白包括釉原蛋白(amelogenin,AM)和非釉原蛋白[1,2],全程參與釉質礦化的調控[3,4]。AM占釉基質蛋白的90%[5,6],在釉質發育時,其單體分級自組裝形成納米球、納米鏈及納米網狀結構,形成引導羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)晶體生長的礦化骨架。牙釉質一經損害難以再生,目前臨床治療方法大多采用各種人工替代材料進行修復,但均難再現天然牙釉質的外觀、精妙結構和各種性能。故研究者們將目光投向“仿生礦化”領域,致力于利用生物分子模板在體外引導牙釉質再生,其中AM備受關注。在AM調控晶體礦化的過程中影響因素眾多,其中pH值是主要影響因素[7]。本研究著重探尋在人AM誘導HA晶體成核、生長的過程當中pH值的影響。

1 材料與方法

1.1 材料于2019年6月至2020年2月,收集正畸患者因治療要求拔除的處在釉質發育階段的下頜第三磨牙牙胚,全部取樣均征得患者及其監護人同意,均由四川省醫學科學院·四川省人民醫院齒槽外科提供。Trizol RNA分離試劑、質粒提取試劑盒、pET-28a(+)載體、大腸桿菌BL21plys(賽默飛世爾科技有限公司)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Western Blot試劑盒(上海生工生物工程有限公司)、PBS、HCl、NaOH(天津市福晨化學試劑廠)、磷酸鎢(河南銳欣實驗用品有限公司)、Tris-HCl、MgCl2、CaCl2·H2O 、KH2PO4、KCl、NH4Cl、HEPES、NaF(武漢德晟生化科技公司)。透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)、臺式掃描電子顯微鏡(phenom公司)、X射線衍射儀(日本Rigaku公司)。本研究獲得我院倫理委員會審批。

1.2 重組AM的表達從收集到的第三磨牙牙胚中提取出牙胚細胞的總RNA,設計AM引物如下。AM上游引物序列:5′-CGCGGATCCATGGGGACCTGGATTTT-3′,下游引物序列:5′- CGAGCTCTTAATCCACTTCCTCCCGC-3′。通過RT-PCR反轉錄、擴增得到AM的cDNA片段,與pET-28a(+)載體進行質粒構建后轉入大腸桿菌BL21plys誘導表達,SDS-PAGE檢測、Western Blot驗證后純化得到AM蛋白。

1.3 蛋白儲備液及人工唾液的配制蛋白儲備液:將純化后的1 ml 0.5 mg/ml的AM溶于0.25 ml預冷pH=3.5的5 mM PBS中,配制成2 mg/ml的AM儲備液,調節初始pH=3.5,4 ℃下溶解24 h以確保蛋白完全溶解,4 ℃下離心20 min去除灰塵和微粒雜質,-80 ℃凍存備用。人工唾液:含MgCl20.2 mM,CaCl2·H2O 1 mM,KH2PO44 mM,KCl 16 mM,NH4Cl 4.5 mM,HEPES 20 mM,預冷的0.1 M HC1和0.1 M NaOH分別調整人工唾液pH至6.4、7.4、8.4、9.4、10.4,使用前加入300 ppm NaF。

1.4 AM不同pH值下的體外自組裝實驗取20 μl pH=3.5的2 mg/ml AM儲備溶液,用60 μl 5 mM PBS(pH分別等于5、6、7、8、9)稀釋,調節溶液pH分別為5、6、7、8、9,添加5 mM PBS(pH分別等于5、6、7、8、9)定容為200 μl,得到200 μg/ml的不同pH值的AM溶液。分別取出20 μl蛋白溶液滴到碳支持膜正面,室溫下分別孵育5、30 min。取出碳支持膜吸干水分,磷酸鎢染色2.5 min。透射電鏡下觀察碳支持膜上AM的自組裝情況。

1.5 AM在不同pH值下誘導HA晶體生成取20 μl 2 mg/ml的AM儲備液加60 μl 50 mM Tris-HCl溶液(pH=7.4)稀釋,用pH=8.0的50 mM Tris-HCl溶液調節pH=7.4,再加入pH=7.4的50 mM Tris-HCl定容到200 μl,得到最終濃度為200 μg/ml、pH=7.4的AM溶液。實驗分組如下:①空白組:細胞爬片取出后不做任何處理,置于24孔板的2 ml pH=7.4的人工唾液中,密封后于37 ℃恒溫培養箱孵育。②對照組:細胞爬片取出后,吸取20 μl 50 mM Tris-HCl溶液(pH=7.4)涂布于細胞爬片表面,室溫下孵育30 min后轉移至24孔板的2 ml pH=7.4的人工唾液中,密封后于37 ℃恒溫培養箱孵育。③實驗組:細胞爬片取出后,吸取20 μl 200 μg/ml、pH=7.4的AM溶液涂布于細胞爬片表面,室溫下孵育30 min后分別轉移至24孔板的2 ml pH=6.4(實驗組1)、7.4(實驗組2)、8.4(實驗組3)、9.4(實驗組4)、10.4(實驗組5)的人工唾液中,密封,37 ℃恒溫培養箱孵育。以上實驗組每天更換新鮮人工唾液,4天后取出牙片,ddH2O反復清洗3次,室溫自然干燥。

1.6 掃描電鏡及X射線衍射分析采用臺式掃描電鏡觀察孵育4天后的各組細胞爬片上沉積物的形貌,操作步驟為:吹凈表面雜質,導電膠固定樣品,噴金60 s,放入掃描電鏡真空室進行觀察并拍照。選擇誘導結果最佳的實驗組礦化產物進行X射線衍射分析,即采用X射線衍射儀對pH=7.4時AM誘導4天生成的晶體進行結構測試。

2 結果

2.1 蛋白表達結果純化后的目的蛋白經過SDS-PAGE電泳分析,在23 kDa左右的位置出現了明顯藍色條帶,與AM蛋白理論分子量相符,初步確定表達純化了目的蛋白。Western Blot檢測在23 kDa左右的位置也出現了相應條帶,進一步說明目的蛋白為AM。見圖1。

圖1 目的蛋白表達檢測結果 a:目的蛋白的SDS-PAGE分析圖;b:目的蛋白的Western Blot檢測圖

2.2 AM在不同pH值下的自組裝結果AM在pH=5的PBS溶液中孵育5 min后,AM單體形成的多聚體獨立分布于溶液中(圖2A紅色箭頭);繼續孵育25 min,多聚體排列形成 “單鏈網狀”結構(圖2B白色框)。

圖2 AM在不同pH值下自組裝的透射電鏡結果 a、b:pH=5; c、d:pH=6; e、f:pH=7; g、h:pH=8; i、j:pH=9

AM在pH=6的PBS溶液中孵育5 min,多聚體均勻散在分布,直徑約為10 nm(圖2C紅色箭頭);繼續孵育25 min,有“雙鏈網狀”結構(圖2D紅色框)生成,邊界較5 min時顏色更深更清晰(圖2D白色箭頭)。

AM在pH=7的PBS溶液中孵育5 min后,多聚體大部分散在均勻分布,少部分進一步聚集,有形成納米球趨勢(圖2E紅色箭頭);繼續孵育25 min,納米球結構不明顯,但多聚體的聚集趨勢比pH=6時大,有“多鏈網狀”結構(圖2F紅色框)生成,邊界較5 min時顏色更深更清晰(圖2F白色箭頭)。

AM在pH=8的PBS溶液中孵育5 min后,單體形成的多聚體大部分散在均勻分布,邊界較pH=7和pH=6時光滑清晰(圖2G紅色箭頭),少部分有進一步聚集趨勢(圖2G紅色框);繼續孵育25 min,可見非常明顯的納米球生成,直徑約50 nm(圖2H白色框)。這些納米球進一步聚集形成更大的球形多聚物(圖2H紅色框)、“串珠狀” 結構(圖2H藍色框)等,并且有進一步組裝成網狀趨勢(圖2H黑色框)。

AM在pH=9的PBS溶液中孵育5 min后,部分多聚體仍然單獨分布,另一部分有聚集形成納米球趨勢(圖2I紅色箭頭);繼續孵育25 min,有明顯直徑較大的“納米球”結構生成,約100～150 nm(圖2J紅色框),大部分散在分布,少部分進一步聚集成“球狀”(圖2J黑色框)或“串珠狀” (圖2J白色框)。見表1及圖2。

表1 AM在不同pH值下的自組裝結果

2.3 AM在不同pH值下的礦化結果

2.3.1空白組及對照組的礦化結果 空白組細胞爬片僅可見無結構的片狀、板狀礦化物沉積;對照組細胞爬片可見由礦物離子形成的圓形的鈣化球沉積,排列散亂無規則。與HA晶體及釉柱的針狀、棒狀結構完全不同。見圖3。

圖3 空白組及對照組礦化4天后的掃描電鏡結果 a、b:空白組;c、d:對照組

2.3.2AM在不同pH值的人工唾液中的礦化結果 AM在pH=6.4的人工唾液中礦化4天后,誘導生成了直徑為0.4～0.6 μm的粗大柱狀礦化產物(圖4A、B白色箭頭),柱狀晶體內無針狀纖維的分級結構,與HA晶體的分級構造不同。同時可見散在的圓球形鈣化小球(圖4B紅色框)。

圖4 AM在不同pH值的人工唾液中礦化4天后的掃描電鏡結果 a、b:pH=6.4; c、d:pH=7.4; e、f:pH=8.4; g、h:pH=9.4; i、j:pH=10.4

AM在pH=7.4的人工唾液中礦化4天后,生成了直徑為100～150 nm,長度為2～2.5 μm的針狀晶體(圖4D白色箭頭),針狀晶體進一步接近平行地捆綁聚集成直徑為0.5～2 μm的晶體束(圖4C、D紅色方框)。這種由納米級微纖維進一步組裝成更粗的晶體束纖維的過程與牙釉質七級結構中HA晶體納米到微米級結構的組成過程十分相符。

AM在pH=8.4的人工唾液中誘導礦化4天后,生成了“花蕾狀”結構(圖4E、F紅色框),由直徑約為80～100 nm,長度約為300～500 nm的針狀晶體聚集而成(圖4F白色箭頭),相互之間成角大。

AM在pH=9.4的人工唾液中誘導礦化4天后生成的晶體相對無序,雖然生成了“針狀”納米級纖維,但直徑僅為50～90 nm,長度100～400 nm(圖4H白色箭頭),少部分聚集捆綁成“花蕾狀”結構(圖4G紅色框),大部分呈“叢狀”(圖4H白色框)。

AM在pH=10.4的人工唾液中誘導礦化4天后,生成的晶體較前幾組更短更細,直徑約為20～40 nm,長度僅約80～100 nm(圖4J白色箭頭),排列疏松且無明顯取向,呈“叢狀”(圖4J白色框),也有較小的“仙人球狀” 結構(圖4K紅色框),與HA晶體近似平行排列的取向差別較大。

2.4 X射線衍射結果AM在pH=7.4的人工唾液中礦化4天后所得沉積物的X射線衍射光譜在2 θ衍射角為 25.8°,31.8°,33°和46.7°時出現衍射峰,與HA晶體(002)、(211)、(300)和(222)的特征峰一致,表明新沉積的礦物質是HA晶體。見圖5。

圖5 AM在pH=7.4時礦化產物的X射線衍射結果

3 討論

AM主要由疏水性N末端、疏水性中央區域和親水性C末端三部分組成[8,9],其中C末端以及N末端高度保守,是AM的主要功能域。AM自組裝形成納米球、微帶和納米鏈[10],被認為是引導HA晶體形成的關鍵驅動力[11],而其鈣結合基序-N端16位絲氨酸的磷酸化可以提高結合鈣離子的能力,C末端結構域帶高電荷,以有利的方式自身定位,允許其與HA晶體表面的離子相互作用,引導晶體形成[12]。

AM的自組裝特性高度依賴pH值[13],在溶液中以pH依賴的方式自組裝成超分子結構[14]。低pH值與AM的等電點相差甚遠,酸性氨基酸側鏈可以大部分被質子化,而其C端肽具有高濃度的酸性氨基酸,可通過帶負電和帶正電的氨基酸之間的靜電相互結合相互作用,C端肽酸性氨基酸的質子化可能會影響蛋白質-蛋白質、蛋白質-礦物質的相互作用和自組裝模式,從而影響AM的自組裝及其對礦物質形成的調節作用[15]。

近年來,研究者們嘗試使用AM作為仿生礦化模板體外誘導HA晶體的生成,對AM的結構、功能和作用的研究已經取得了重大進展。Fan等[16]發現重組豬AM rP172在pH=4.8,37 ℃條件下誘導生成了納米棒狀結構;Uskokovic等[17]使用重組人AM rH174在pH=7.4、37 ℃條件下誘導生成了片狀晶體;Ruan等[18]發現重組豬AM rP172-殼聚糖水凝膠在300 ppm F-、pH=7.0、37 ℃條件下生成了形態接近HA晶體的針狀納米結構;Prozorov[19]研究表明重組鼠AM rM179在pH=7.4、37 ℃條件下可生成彎曲的條狀晶體。些許實驗條件的差異得到形貌各異的晶體結構,說明在AM調控晶體礦化的過程中影響因素眾多,如誘導溫度、F-強度、pH值、磷酸化等。其中,pH值是主要影響因素,但影響細節仍然存在爭議,且礦化模板大多使用動物蛋白,其蛋白的分泌軌跡、組裝方式以及作用機制與人AM有所區別。故本研究在體外表達了人的AM全長,并依據人AM在不同pH值下的體外自組裝行為設置pH梯度,觀察人AM在不同pH值下的體外礦化能力。

自組裝實驗表明AM在酸性條件下無明顯聚集趨勢,在中性、堿性條件下有典型納米球結構生成。當pH=7時,聚集趨勢變明顯,直至pH=8時出現典型的自組裝過程,但在這區間自組裝行為變化的臨界點并不清晰。故在設計進一步AM的體外礦化實驗時:①擯棄過低的pH值(pH=5、6);②在pH值7～8選擇pH=7.4(體內釉質發育分泌期的生理性pH);③設置梯度為1;④設置略偏酸性的pH=6.4增加容錯率;⑤堿性條件設置幾個pH值(堿性條件仍可見納米球生成)。最終設計AM礦化實驗的pH梯度為6.4、7.4、8.4、9.4、10.4。

AM在pH=6.4時誘導生成的柱狀晶體內無針狀纖維的分級結構,與HA晶體的分級構造不同,這與AM在酸性條件下自組裝過程不明顯的結果相符。AM在pH=7.4時在細胞爬片上誘導生成了直徑為100～150 nm,長度為2～2.5 μm的針狀晶體,這些針狀晶體接近平行地進一步捆綁聚集成直徑為0.5～2 μm的晶體束。這種由納米級微纖維進一步組裝成更粗的晶體束纖維的過程與牙釉質七級結構中HA晶體納米到微米級結構的組成過程十分相符,同時與自組裝實驗預測在pH=7上升至pH=8之間出現AM典型功能性自組裝過程的結論一致。AM在pH為8.4、9.4、10.4的堿性環境下,生成的針狀晶體直徑逐漸變小,長度也逐漸變短,且排列取向逐步趨向散亂,與HA晶體的排列差別較大,這與堿性條件下AM自組裝形成的納米球大部分散在分布的結果一致。

綜上所述,AM的自組裝過程和礦化能力對pH值非常敏感,在pH=7～8開始出現典型的多級自組裝行為,在pH=7.4時可以成功誘導出與天然牙釉質相似的HA晶體。這一研究結果能為設置AM體外誘導牙釉質再礦化的最佳條件奠定基礎。