線粒體病的分子診斷與疾病標志物

董起鈺,尹筱婕,鐘 聲,范雙龍,方合志,王 婭

(浙江省醫學遺傳學重點實驗室,溫州醫科大學檢驗醫學院生命科學學院,浙江 溫州 325035)

線粒體疾病(也稱線粒體病)是兒童時期最為常見的一類先天性遺傳代謝病,目前尚無根本的治療方法。因此,早發現、早診斷對于線粒體病的防治至關重要。由于線粒體病臨床表型的多樣性和復雜性,導致線粒體病診斷尤為困難,極易漏診誤診,往往需要結合臨床、病理、生化以及分子檢測綜合進行診斷。其中臨床診斷是線粒體病診斷的基礎,但當臨床不能確診時,分子診斷對線粒體病的確診起到了“一錘定音”的作用。本文主要介紹了線粒體病的分子診斷策略和疾病診斷標志物。

1 線粒體病

線粒體病最早發現于1962年,并被定義為一類存在氧化磷酸化(OXPHOS)功能異常的遺傳代謝性疾病。隨著酶生化技術、細胞學、尤其是基因組學技術的發展,線粒體病被進一步定義為:一類線粒體功能異常所導致的疾病,其中OXPHOS功能缺陷是其主要特征[1]。線粒體病臨床表現多樣,可累及人體多個臟器[2],疾病亞型多達300余百種,其中常見的線粒體病有線粒體腦肌病伴乳酸酸中毒和卒中樣發作綜合征(MELAS)、亞急性壞死性腦病(Leigh綜合征)、Kearns-Sayre綜合征(KSS)、慢性進行性眼外肌癱瘓(CPEO)、肌陣攣性癲癇伴肌肉蓬毛樣紅纖維綜合征(MERRF)等。雖然單一的線粒體疾病亞型發病率低,但總發病率可高達1/5000[3],是兒童時期最為常見的先天性遺傳代謝病。已知有1200余種蛋白定位于線粒體中,其中絕大多數蛋白質由核基因(nDNA)編碼,而線粒體基因(mtDNA)僅編碼了其中的13種亞基,2種rRNA和22種tRNA[4]。因此,線粒體病的遺傳方式可分為nDNA突變介導的孟德爾遺傳方式和mtDNA突變介導的母系遺傳方式。

2 線粒體病的遺傳特點

線粒體是一個半自主性細胞器,能夠進行自我復制、轉錄和翻譯。與nDNA相比,mtDNA具有如下特點:①母系遺傳,這是因為精子在發育成熟后只有很少的線粒體,且在受精后自行降解,子代中mtDNA幾乎全部來自于卵細胞,而表現為母系遺傳。但近年研究也顯示在少數情況下,父親可以將mtDNA遺傳給后代;②復制分離,在細胞分裂過程中,mtDNA隨機分配到子細胞中,導致子細胞含不同比例的突變mtDNA分子。分裂旺盛的細胞往往會排斥突變型mtDNA,使細胞中野生型mtDNA比例逐漸增加。而在分裂不活躍的細胞中則出現相反的情況[5];③高突變率,主要因為mtDNA無組蛋白保護,缺乏損傷修復系統,且與線粒體內膜相連,極易被呼吸鏈代謝產生的氧自由基損傷;④閾值效應,突變型mtDNA達到一定水平導致線粒體產能急劇下降,組織或器官缺乏能量供應從而表現出臨床癥狀。能量需求越高的組織器官的閾值越低,對線粒體功能異常越敏感[6]。

3 線粒體病的分子診斷與疾病標志物

3.1 線粒體病分子診斷由于線粒體病臨床表現的多樣性和復雜性,給線粒體病的診斷帶來巨大挑戰。線粒體病的診斷需結合臨床診斷、肌肉病理學檢查、生化檢測以及分子診斷綜合進行分析[7]。臨床診斷是線粒體病診斷的基礎,但當臨床不能確診時,分子診斷起到了決定性作用。1988年,Wallace等首次發現m.11778G>A是Leber’s遺傳性視神經病(LHON)的致病突變[8]。隨后Goto等在1990年發現了第二個線粒體病致病突變(m.3243A>G)[9]。過去十幾年隨著高通量測序在線粒體病分子診斷中的應用,至今已發現400余個線粒體致病基因。由于線粒體病基因型-表型間存在一定關聯,因此可結合臨床表現,針對性進行基因檢查。見表1。

表1 線粒體病相關基因突變及臨床表現

Leigh綜合征又稱為亞急性壞死性腦病,是由遺傳缺陷導致線粒體功能障礙引起的神經退行性病變,發病率約為1/40000[10]。Leigh綜合征起病早,病程進展迅速,預后較差。病因復雜,主要由線粒體呼吸鏈復合體缺陷(ACAD9、NDUFS1、SDHA等核基因或MTND1、MTCO3等線粒體基因突變導致);丙酮酸羧化酶或丙酮酸脫氫酶復合物缺陷(DLD、PDHA1、TPK1等基因突變導致);輔酶Q等輔助因子合成障礙(COQ9、PDSS2突變導致),患者腦干、雙側基底節區、小腦、脊髓等部位對稱性局灶性壞死,并表現生長發育遲緩、肌力下降或肌張力異常等臨床癥狀。

MELAS綜合征是一種常見的線粒體腦肌病,患者臨床多表現為癲癇、卒中樣發作、頭痛等,基因檢測是確診MELAS綜合征的重要標準[11]。自Goto等于1990年首次報道m.3243A>G突變導致MELAS的病例,更多的mtDNA變異位點被發現,如m.3271T>C、m.3252A>G、m.3291T>C、m.3260A>G等,其中大部分突變位于mtDNA的tRNA基因區域。

MERRF綜合征又稱肌陣攣癲癇伴破碎紅纖維綜合征,是線粒體腦肌病的一個亞型,患者多在兒童期發病。由于突變基因或位點不同,患者的臨床表型各異,以肌陣攣性癲癇發作為主要特征, 可伴有智力減退、小腦共濟失調等,此外,還會出現如甲狀腺功能減退等其他內分泌系統疾病。線粒體DNA突變導致線粒體氧化磷酸化功能缺陷是發病的根本原因,m.8344A>G、m.8356T>C、m.8361G>A和m.8363G>A是常見的致病性突變,其中m.8344A>G是MERRF相關的熱點突變。

LHON又稱Leber遺傳性視神經萎縮,該病于1871年首次報道,以雙眼出現無痛性視力下降為首發癥狀,隨著病情進展,可出現顯著的雙側視神經萎縮,伴隨或不伴隨其他多系統癥狀,如運動障礙、癲癇、聽力障礙等。約95%的LHON患者由m.11778G>A、m.14484T>C和m.3460G>A這三個點的突變引起。

Kearns-Sayre綜合征于1958年由Kearns和Sayre首次報道,是一種以慢性進行性眼外肌麻痹、視網膜色素變性和心臟傳導功能障礙三聯征為主要特征的線粒體腦肌病。KSS最常見病因是由DNA的重排導致的線粒體DNA單個或多個片段缺失,常見的致病性突變位點包括m.4298G>A、m.4308G>A、m. 5703G>A和m.12315G>A等。

3.2 線粒體病分子診斷技術mtDNA突變形式有多種,包括點突變、重復和缺失等,其中主要以點突變為主。mtDNA突變的檢測方法主要包括PCR-RFLP和PCR-ASO等。對于A3243G、T8993G等常見的線粒體DNA點突變,通常使用PCR-RFLP法。該方法是通過PCR擴增一段含有突變位點的mtDNA,然后再使用合適的限制性內切酶,酶切PCR產物,經瓊脂糖凝膠電泳得到特異性的電泳譜帶,野生型mtDNA所得的PCR產物會被切成2個片段,從而鑒定該位點是否發生突變。該方法較簡便,特異性高,適合同時檢測多個樣本,并且通過掃描野生型及突變型DNA條帶信號強度可以粗略計算突變型mtDNA的比例。但此方法耗時,結果不穩定,限制性內切酶可能消化不完全。此外,PCR-RFLP法可能無法檢測到低百分比(<15%)的異質性。為了更有效地診斷線粒體病,可使用多重PCR /等位基因特異性寡核苷酸(ASO)點印跡雜交方法。患者DNA樣本含有野生型或突變型mtDNA,將其PCR產物與相應的核酸探針雜交,野生型的mtDNA只結合正常探針,同質突變型的mtDNA只結合突變探針,而異質突變型的mtDNA將與野生型和突變型ASO探針雜交。該方法靈敏度高,能同時分析多個位點突變。對于低百分比的突變異質性也可以檢測。但不能進行定量檢測。

對于大片段缺失可采用Southern雜交進行檢測,基本原理是經限制性內切酶酶切后的DNA片段,瓊脂糖凝膠電泳及變性后,轉移至固相支持物上,與相應的標記探針進行雜交。使用Southern雜交時需注意檢測樣本的選擇。由于mtDNA缺失的線粒體病患者,其不同組織中含有的突變型mtDNA比例不同,在肌肉和腦等組織中突變型mtDNA比例較高,但在血液中可能檢測不到。

對于一些尚不清楚的點突變可采用單鏈構象多態性(SSCP)、變性高效液相層析(dHPLC)、變性梯度凝膠電泳(DDGE)及DNA測序等進行檢測。SSCP是基于單鏈DNA構象的差別來檢測突變。相同長度的單鏈DNA由于堿基序列不同,形成不同的空間構象,在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現為不同的遷移率,區分野生型DNA和突變型DNA。SSCP操作簡單,能夠快速、有效地檢測各種類型的突變,如點突變、缺失和重復等,但如果突變導致空間構象變化微小,遷移率相差無幾,會出現假陰性,進而影響檢測的靈敏度。dHPLC方法可以篩查未知單核苷酸多態性和突變,具有高通量、自動化、特異性高、快速等優點,是分析異質性突變首選的檢測方法。該方法主要通過PCR擴增得到相同長度的DNA片段,突變型DNA片段和野生型DNA片段只有一個位點的差異,退火后可形成同源雙鏈和異源雙鏈,兩者在層析柱中的移動速度不同,異源雙鏈因有錯配區的存在而更易變性,在色譜柱中的保留時間短于同源雙鏈,故先被洗脫下來,野生型和突變型得以區分,由此達到檢測基因突變的目的。目前也有許多研究將DDGE變性高效液相層析技術用于檢測mtDNA突變[12]。因不受其他篩選方法敏感性和特異性的限制,DNA測序技術是進行突變分析最直接和最準確的方法,已成為檢測基因突變的金標準。DNA測序技術主要包括第一代測序技術(Sanger測序)、第二代測序技術(NGS)和第三代測序技術。近年來,NGS被廣泛用于研究mtDNA缺陷,主要適用于檢測mtDNA大片段缺失和異質率,已成為mtDNA遺傳分析的首選方法[14～18]。NGS主要包括全基因組測序(WGS)和全外顯子測序(WES),其中WGS是對生物體整個基因組序列進行測序,可以獲得完整的基因組信息,能夠鑒定出基因組上任何類型的突變,覆蓋內含子和外顯子區域,能同時分析線粒體基因組項目以及動態突變項目。不同于WGS,WES關注基因組的外顯子區域,即蛋白質編碼區域,是目前更適用于臨床的高深度測序技術。雖然外顯子組只占基因組的1%～2%,卻包含約85%的致病突變。與全基因組測序相比,全外顯子測序檢測目標區域明確,更加經濟高效,對研究SNP、InDel等具有較大的優勢,可以憑借高深度測序鑒定到全基因組測序所沒有鑒定到的突變,但不能檢測大片段缺失。DNA測序技術促進了突變鑒定速度的提高以及新致病基因的發現,助力了線粒體病快速診斷[13]。總之,這些技術推動了線粒體病分子診斷的迅速發展,為臨床快速確診提供了更精準的信息。

3.3 線粒體疾病標志物與線粒體功能障礙相關的多種生化物質統稱為線粒體疾病標志物,包括腦脊液乳酸、丙酮酸、血氨基酸、尿有機酸等,上述標志物水平的檢測對線粒體病診斷具有重要意義。

乳酸/丙酮酸比值。線粒體病患者安靜時腦脊液、血清和尿液中的乳酸水平通常升高,導致乳酸與丙酮酸比值隨之變化,一般認為安靜時乳酸與丙酮酸比值大于20,提示患者線粒體呼吸鏈復合體功能缺陷和丙酮酸代謝受損[19]。但值得注意的是,運動和抽血應激會導致患者血乳酸水平急劇上升,因此測定乳酸水平時需排除該干擾因素。

血漿氨基酸及尿有機酸。血漿氨基酸及尿有機酸檢測一定程度上也可幫助鑒別線粒體病。目前在臨床上多采用串聯質譜法進行血漿氨基酸和尿有機酸檢測。患者血漿中丙氨酸水平異常升高,提示線粒體功能障礙。臨床上一般將丙氨酸與酪氨酸等必需氨基酸進行比較,以明確丙氨酸水平的相對值是否升高。MELAS綜合征患者的血漿瓜氨酸水平降低[20];部分丙酮酸脫氫酶缺陷患者的纈氨酸等支鏈氨基酸水平升高。有機酸作為機體代謝的副產物,在線粒體病患者尿液中的水平會出現異常改變,如Barth綜合征患者尿液中3-甲基葡聚糖酸水平明顯升高;SUCLA2缺乏征患者甲基丙二酸水平明顯升高;MEGD(H)EL綜合征患者3-甲基戊烯二酸水平升高。

此外,有報道線粒體患者體內成纖維細胞生長因子21(FGF21)[21]和生長分化因子15(GDF15)[22]水平升高,但也有文章指出FGF21和GDF15在肝臟受損的非線粒體病患者體內也會異常升高[23],二者在繼發性線粒體病診斷過程中的靈敏度較以往報道低[24],因此并不能將二者作為線粒體病的特異性指標,僅可作為輔助診斷依據。

4 小結

目前線粒體病的診斷需結合臨床診斷、病理檢查、生化檢測以及分子診斷綜合進行分析。在臨床疑診時,分子診斷對線粒體病的確診起到了關鍵性作用。此外,檢測線粒體疾病標志物水平也有助于線粒體病的及時診斷。隨著分子生物學和高通量測序技術的發展和應用,相信未來會發現更多線粒體病致病新基因和新突變,也會有更加方便和精準的技術用于線粒體病的生化檢測,并通過大量的臨床研究發現更多可靠的線粒體疾病標志物,從而提高線粒體病的診斷效率。