血清外泌體miRNA在類風濕關節炎診療中的潛在應用價值

楊 平,龔建民,梁 軍,嚴 虹

(1. 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 a.檢驗科,b.風濕免疫科,江蘇 南京 210008;2. 長江大學生命科學學院,湖北 荊州 434025;3. 南京醫科大學第二附屬醫院檢驗醫學中心,江蘇 南京 210011)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以全身性炎癥和關節疼痛、腫脹、畸形為主要特征的自身免疫性疾病,并且可累及到肺部、心臟和眼睛等關節外器官[1]。目前臨床用于RA診斷的實驗室指標主要是抗瓜氨酸蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibody,ACPA)和類風濕因子[2](rheumatoid factor,RF)。RF在70%～80%的RA患者中均可檢測到,但其特異性較低[3];ACPA則更具有特異性,通常與RF同時升高[4]。然而,據報道仍有15%～25%的RA患者的兩類抗體均陰性[5],這無疑對臨床醫生的診療提出了挑戰,尤其是在早期鑒別階段。更重要的是,ACPA陰性RA與ACPA陽性RA從病因、病理到疾病免疫微環境都有所不同[6～8]。因此,探尋RA新型標志物鑒定不僅對RA的早期識別至關重要,而且有助于揭示RA潛在的致病機制。新近表觀遺傳學研究表明微小RNA(microRNA,miRNA)與RA的發生、發展密切相關[9～11]。外泌體是細胞來源的直徑約為30～100 nm的具有膜結構的微囊泡,可以介導體內細胞間的遠程通訊,其中間充質干細胞來源的外泌體被報道可以用于RA的治療[12]。外泌體也是循環miRNA的重要載體,可有效保護miRNA免受降解。然而,關于外泌體miRNA是否能夠作為RA診斷的標志物以及如何參與RA的發病尚不明確。因此,本研究擬通過對RA患者血清外泌體進行小RNA測序篩選結合大樣本qPCR進行驗證,初步探討外泌體miRNA在RA診療中的潛在臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2021年2月至2022年6月在南京大學醫學院附屬鼓樓醫院風濕免疫科就診的RA患者132例,其中男31例,女101例。RA患者全部符合美國風濕病學會及歐洲抗風濕病聯盟(ACR/EULAR)2010年共同修訂的RA診斷標準。選擇同期來院體檢健康志愿者127例為對照組(HC組),其中男25例,女102例,排除糖尿病、惡性腫瘤以及其他自身免疫性疾病。兩組間年齡、性別比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。RA患者和對照組各選擇24例作為訓練集,剩余108例RA患者和103例對照組作為測試集;同時收集10例正常體檢患者,14例RA患者,10例強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)患者,12例系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)患者,11例銀屑病關節炎(psoriatic arthritis, PsA)患者用于小RNA標志物的特異性分析。同時,收集了9例嚴格入組的經甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)穩定劑量治療的成年活動性類風濕關節炎患者,分別檢測其治療前基線水平和治療后第29天的血清外泌體miRNA水平。收集RA患者腫脹關節數(tender joint count,TJC28)、疼痛關節數(swollen joint count,SJC28)、疾病活動評分(disease activity score,DAS28)-CRP、DAS28-ESR、患者總體評價,根據美國風濕病學會(ACR)改善標準對RA患者治療的臨床效果進行評估。本研究經南京大學醫學院附屬鼓樓醫院倫理委員會審核批準(項目編號:2021-280-01)。

表1 RA組和HC組一般臨床資料比較

1.2 樣本采集與檢測方法所有受試者均空腹靜脈采血,ESR檢測用枸櫞酸鈉抗凝管,其余項目用帶分離膠血清管,以3000×g相對離心力的速度離心10 min,分離血清,所收標本放于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.3 外泌體RNA提取以及小RNA測序分析

1.3.1外泌體分離 使用Exo-Quick-TCTM、Total Exosome Isolation(Invitrogen)試劑盒獲得外泌體。根據試劑盒提供說明嚴格進行以下步驟:將血清16000 g離心30 min取上清,將血清與沉降試劑按照5∶1的比例進行混勻,置于冰上孵育30 min,10000 g離心10 min即可獲得外泌體沉淀,接著用純凈的PBS溶液重懸外泌體。

1.3.2外泌體表征及RNA提取 使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察外泌體形態,使用粒徑分析儀(Zetaview)分析外泌體粒徑分布,最后通過蛋白印跡(western blot,WB)鑒定外泌體膜特異性蛋白。使用Trizol裂解法提取外泌體總RNA,具體步驟如下:向外泌體中加入1 ml Trizol(Invitrogen),充分混勻,靜置5 min;加入200 μl氯仿,充分混勻,于4 ℃靜置7 min;16000 g離心20 min,取上清,加入等體積異丙醇,-20 ℃沉淀過夜;4 ℃ 16000 g離心20 min,棄上清;加入1 ml 75%乙醇,4 ℃ 16000 g離心20 min,棄上清,倒置晾干,使用ddH2O重懸,即可得外泌體總RNA。

1.3.3miRNA高通量測序及篩選 使用Qubit熒光計和瓊脂糖電泳檢測RNA樣本的濃度和純度,將外泌體RNA送至華大基因公司進行測序。測序包括RNA樣本添加3’和5’端接頭、逆轉錄、PCR擴增、選擇合適大小文庫、文庫定量和上機測序,所用的測序儀器為Illumina二代測序系統。接著過濾測序數據,刪除重復和缺失,與數據庫進行比對,使用R語言等生物信息學工具進行分析和注釋,選取差異表達的miRNA進行后續的臨床樣本驗證。

1.4 RT-PCR分析miRNA的檢測主要包括逆轉錄和熒光定量PCR兩個步驟,選用的是在miRNA研究領域較成熟的莖環引物進行試驗。首先使用miRNA design軟件設計miRNA逆轉和定量引物,使用miRNA 1stcDNA Synthesis Kit(南京諾唯贊生物)試劑盒合成cDNA,再用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物)試劑盒進行定量PCR。以上所有樣本的定量檢測均在BIO-RAD CFX96 PCR儀(美國伯樂公司)上完成。

1.5 統計學方法采用GraphPad Prism8.0及SPSS 24.0統計學軟件進行數據分析。計數資料以頻數和百分比表示,組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法;非正態分布的計量資料用M(P25,P75)表示,組間比較采用非參數Mann-WhitneyU檢驗;使用Pearson相關分析相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 篩選差異表達的外泌體miRNA并進行小樣本初篩根據∣log2 FC∣>2,P<0.05的標準對測序原始數據進行分析,篩選出8個在RA組低表達的miRNA,在24對RA患者和健康患者中進行初步驗證,發現miR-11400在RA組中顯著低表達(P<0.05)。見表2。

表2 RA組低表達外泌體miRNA標志物的篩選

2.2 對外泌體miR-11400進行大樣本驗證和診斷效能評估對鑒定出的關鍵miR-11400在大樣本隊列(103例HC健康志愿者,108例RA患者)中進行驗證,ROC曲線下面積為0.7546(圖1a)。將miR-11400進一步在ACPA陰性RA患者中進行驗證,發現仍然保持極佳的診斷效能,ROC曲線下面積為0.9778(圖1b)。

圖1 外泌體miR-11400的大樣本驗證和診斷效能分析 a:大樣本隊列;b:ACPA陰性RA患者

2.3 外泌體miR-11400與RA臨床指標的相關性分析RA組血清外泌體miR-11400水平與CCP、CRP、MCV和RF均呈負相關(P<0.05)。見表3。

表3 外泌體miR-11400與臨床指標的相關性分析

2.4 外泌體miR-11400在其他自身免疫性疾病中的特異性分析與HC組比較,外泌體miR-11400只在RA組特異性低表達(P<0.01),而在AS組、SLE組及PsA組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 外泌體miR-11400在其他自身免疫性疾病中的特異性分析

2.5 外泌體miR-11400在RA患者療效觀察中的價值入組9例連續口服(MTX)穩定劑量(每周劑量7.5～25 mg)治療的活動性RA患者,觀察其治療前基線水平以及第29天(Day 29)的血清外泌體miRNA表達量的變化。結果表明,經MTX治療后第29天外泌體miR-11400表達量呈上升趨勢,同時TJC28、SJC28和DAS28-CRP評分均顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 活動性RA患者MTX治療前后臨床指標比較 (n=9)

2.6 miR-11400可能的機制和信號通路分析采用KEGG分析發現miR-11400主要富集在促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路,而MAPK信號通路與RA的發病機制密切相關。見圖3。

圖3 miR-11400的生物信息學分析

3 討論

RA疾病異質性強,發病機制尚不明確,目前認為其發病可能與家族遺傳、自身免疫、腸道菌群、表觀遺傳等有關[12～14]。北京協和醫院張烜教授在國際上首次報道其團隊通過蛋白芯片技術在累計長達8年收集的上千例標本中篩選出抗PTX3和抗DUSP11兩種新型自身抗體可作為ACPA陰性類風濕關節炎的診斷標志物,同時還闡述了抗PTX3和抗DUSP11自身抗體在細胞焦亡和炎性因子風暴中的致病機制[15,16]。北京大學人民醫院栗占國教授團隊通過一項涉及3262名參與者的訓練和驗證隊列的大規模的多中心研究發現,RA患者的血清可溶性清道夫受體A(soluble scavenger receptor,sSR-A)水平顯著升高,并且與該疾病的臨床和免疫學特征呈正相關。sSR-A被證實可以用于RA的診斷,尤其是對早期和血清陰性RA的診斷,同時還揭示了靶向sSR-A可能是一種新的RA治療策略[17]。然而,這些指標均僅限于科研層面,目前RA的血清診斷主要依據RF和CCP,臨床上仍有部分患者在發病初期甚至患病多年仍缺乏有效生物標志物進行檢測,給臨床診斷和治療帶來困難。因此,尋找新型的標志物用于RA的診斷和預后具有十分重要的臨床意義。

近年來,循環miRNA標志物與類風濕關節炎的關系得到廣泛關注,其動態變化與RA的發病易感性、發病機制、診斷、治療干預及預后密切相關[11,18]。外泌體不僅可以保護循環miRNA免受降解,同時可以通過運輸各種蛋白質和非編碼RNA,在細胞間通信中發揮重要作用[19～21]。本研究首次發現了一種在RA患者血清低表達的外泌體miR-11400標志物,在鑒別RA組和HC組的ROC曲線下面積為0.7546(95%CI為0.6874～0.8217),并且在ACPA陰性的RA中也具備極佳的診斷效能(AUC為0.9978,95%CI為0.9468～1.000)。然后,通過spearman相關性分析發現外泌體miR-11400與RA患者的臨床指標CCP、RF、CRP和MCV均呈負相關,其中與MCV相關性最好,CCP次之,最后是RF和CRP。進一步特異性分析表明,外泌體miR-11400只在RA組特異性低表達,而在AS組、SLE組以及PsA組與HC組比較差異無統計學意義。以上數據表明,外泌體miR-11400可能與RA的發生、發展密切相關,具有很好的臨床價值。

MTX是目前治療類風濕關節炎最為經典的一線藥物,各國指南中均推薦首選單用MTX作為治療藥物[22]。本研究對9例經MTX穩定劑量治療的成年活動性RA患者進行用藥前基線水平以及用藥后第29天血清外泌體miR-11400表達量進行分析,發現其在治療后第29天表達量逐漸增高,同時TJC28、SJC28和DAS28-CRP評分均顯著降低,癥狀趨于好轉,這也表明外泌體miR-11400在一定程度上可以用于輔助風濕科醫師評估RA的治療效果。更為重要是,通過生物信息學分析發現miR-11400主要可能靶向MAPK信號通路,而MAPK信號通路是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一,是正常條件和病理條件下應激反應以及細胞增殖、分化、細胞凋亡的關鍵信號通路,并且被大量文獻報道可能參與RA的發病機制[23～25]。因此,提示miR-11400有可能通過調控MAPK信號通路參與RA的發病,并有可能成為RA治療中的新的靶點。

綜上,本研究發現了miR-11400是一種低表達于RA患者的血清外泌體miRNA,其不僅可以用于RA的診斷,同時可以用于RA治療過程中的動態監測,具有很好的潛在臨床應用價值。同時,通過生物信息學分析揭示了外泌體miR-11400可能通過靶向MAPK信號通路參與RA的發病進程,有望成為RA治療的新的靶點。然而,本次研究未能夠對全部RA患者進行DAS-28評分以及相關影像學的跟蹤,因此在后續的研究中將詳細完善評分和關節超聲、影像學檢查用于更精準地評估患者的活動性。本研究的局限性還在于雖然樣本量較大,但仍屬于單中心、單藥物臨床數據研究,可能存在選擇性、地域性偏倚。因此,在后續的研究中仍需進行跨區域、多中心合作,同時在不同RA治療方案中的場景下去建立療效評估模型,以期能夠將外泌體miR-11400應用于RA患者的臨床診斷和預后評估中去,更好發揮其潛在的臨床應用價值。最后,國內外當前有關外泌體檢測標準化工作尚處于實驗室研究階段,其分離富集方法、技術操作規范、質量控制以及檢測結果的一致性和準確性尚待解決[26,27]。外泌體檢測真正進入臨床應用,仍需提高檢測技術的靈敏度和特異性;實現樣本采集系統和分析步驟等的標準化;通過多中心臨床試驗來綜合評價檢測的臨床效果。相信隨著新興技術的不斷涌現和發展,以及廣大檢驗同仁和科研工作者的不懈努力,外泌體相關標志物研究必將在檢驗領域發揮一定的臨床應用價值。