DNA甲基化作為結直腸癌早期診斷標志物的研究進展

林曉宇,王傳新,杜魯濤

(1.山東大學第二醫院檢驗醫學中心,山東 濟南 250033;2.山東大學齊魯醫院檢驗醫學中心,山東 濟南 250012)

結直腸癌(CRC)發病率在惡性腫瘤中位居第三位,死亡率位居第二位[1]。預計到2030年,結直腸癌的全球負擔增加60%,將有約220萬例結直腸癌新發病例和110萬例結直腸癌死亡病例[2]。結直腸癌患者的生存率與其確診時分期密切相關,I期結直腸癌患者的5年生存率約為91%,而IV期結直腸癌患者的5年生存率僅為14%左右[3, 4]。結直腸癌的早期篩查和診斷可以顯著降低其發病率和死亡率[5]。目前結腸鏡檢查是結直腸癌診斷的金標準,但由于操作具有侵襲性,檢查成本較高,且需要提前腸道準備等,其用于結直腸癌早期篩查的人群依從率較低[6]。因此,迫切需要開發新的準確度高、重復性好、簡便易行的結直腸癌早期篩查手段。表觀遺傳修飾在包括結直腸癌在內的多種惡性腫瘤的發生發展中起著關鍵作用[7]。DNA甲基化是目前研究最多,也是基因組最豐富和最廣泛的一種表觀遺傳修飾,其主要發生在惡性腫瘤的早期階段,這種遺傳修飾改變可以作為腫瘤的早期分子事件提示腫瘤的發生。結直腸癌細胞主要表現出兩種不同的DNA甲基化模式的改變,一種是全基因組的低甲基化,另一種是特定基因啟動子的高甲基化[8, 9]。近年來,隨著對結直腸癌發生發展階段中DNA甲基化模式等表觀遺傳修飾的深入了解以及新型分子診斷技術的不斷進步,血液、糞便、尿液和腸道灌洗液等人體生物樣本中的DNA甲基化等作為結直腸癌早期篩查和診斷的生物標志物的潛能逐漸受到臨床關注。這種新型表觀遺傳修飾標志物具有樣本采集簡便、無創和風險較小等諸多優點,有望成為下一代結直腸癌早期篩查和診斷的新型檢測靶點。本文將系統總結不同來源樣本中DNA甲基化生物標志物在結直腸癌應用中的最新進展,為后續結直腸癌早期篩查和診斷新技術的研發和臨床應用提供參考。

1 血液樣本DNA甲基化在結直腸癌早期診斷中的作用

研究表明,血液中異常的DNA甲基化可能是結直腸癌早期篩查和診斷的潛在生物標志物(表1)。SEPT9是研究最廣泛的結直腸癌單一甲基化標志物,Epi proColon是目前唯一獲得FDA批準用于結直腸癌篩查的血液檢測,已在臨床上使用近10年[10]。有結果顯示,與健康對照者相比,結直腸癌患者組織和血液樣本中SEPT9甲基化水平顯著升高。Wu等研究顯示,血漿樣本中SEPT9甲基化檢測對結直腸癌診斷的敏感性為76.6%,特異性為95.9%[11],然而SEPT9甲基化對早期結直腸癌和晚期腺瘤檢測的敏感性相對較低[12]。Fu等研究表明,結直腸癌患者血漿SEPT9甲基化的陽性率與腫瘤大小、組織學分級和一般組織學類型相關(P<0.05)。術前和術后血漿SEPT9甲基化狀態的改變反映了手術對結直腸癌患者的治療效果,提示SEPT9甲基化在評價結直腸癌治療效果和監測復發方面具有重要的應用潛力[13]。Takane等研究發現,在血漿樣本中,81%的結直腸癌患者PPP1R3C被甲基化,只有19%的非癌癥患者PPP1R3C被甲基化,PPP1R3C和EFHD1聯合檢測可以提高對結直腸癌診斷的敏感性和特異性[14]。KCNJ12和ZNF132是兩種新型的用于結直腸癌診斷的甲基化標志物,檢測結直腸癌的敏感性分別為62.4%和56.3%,特異性為88.7%和97.2%,與其他標志物聯合檢測可以進一步提高診斷的敏感性和特異性[10]。Luo等研究發現,在高危人群中,血漿樣本中cg10673833甲基化檢測對結直腸癌診斷的敏感性為89.7%,特異性為86.8%,進一步結果顯示,其對晚期癌前病變的敏感性為33.3%,略高于SEPT9在檢測癌前病變方面的敏感性[15]。

表1 血液樣本DNA甲基化對CRC的早期診斷

然而,單一甲基化位點的診斷能力比較有限,研究人員嘗試建立基于多個不同甲基化位點的診斷模型,用于結直腸癌的早期檢測。有研究選擇了三個特異性DNA甲基化標記物——C9orf50、KCNQ5和CLIP4作為新的診斷模型,以上標志物都可以獨立區分結直腸癌患者和健康個體的血漿,當三者聯合檢測時能夠達到85%的敏感性和99%的特異性[16]。Bartak等利用SFRP1、SFRP2、SDC2和PRIMA1構建聯合診斷模型,結果顯示該模型診斷結直腸癌的敏感性為91.5%,特異性為97.3%,診斷腺瘤的敏感性為89.2%,特異性為86.5%[17]。以上研究表明,DNA甲基化模式的改變在結直腸腺瘤階段就可以觀察到,且具有比較高的敏感性和特異性,提示DNA甲基化可用于癌前病變的早期診斷。

2 糞便樣本DNA甲基化在結直腸癌早期診斷中的作用

在結直腸癌發生過程中,結腸或直腸腔內出現脫落腫瘤細胞的時間要早于腫瘤細胞開始侵犯血管,因此在結直腸癌早期篩查中糞便樣本比血液樣本更有優勢[18]。隨糞便排出的腫瘤細胞中含有的異常DNA遺傳學改變可以作為結直腸癌早期診斷的潛在生物標志物(表2)。Han等為了評價糞便樣本中SDC2甲基化檢測對結直腸癌診斷的性能,招募了634名受試者,結果顯示SDC2甲基化檢測結直腸癌,與腫瘤分期、位置、性別、年齡等無關的總體敏感性為90.2%,特異性為90.2%,檢測早期階段(0～Ⅱ期)結直腸癌的敏感性為89.1%[19]。另一項研究結果顯示,SDC2甲基化是目前發現的較好的單一基因甲基化標志物,其糞便甲基化檢測的敏感性為83.1%,特異性為91.2%[20]。TFPI2甲基化是人類結直腸癌中的常見事件,Zhang等研究發現糞便樣本中TFPI2甲基化對于結直腸癌檢測的敏感性為68.3%,特異性為100%[21, 22],聯合SDC2甲基化檢測能夠提高對結直腸癌和腺瘤診斷的敏感性[23]。Liu等研究發現了糞便樣本中4個最佳標志物——COL4A1、COL4A2、TLX2和ITGA4,以上標志物檢測結直腸癌的敏感性為82.5%～92.5%,檢測腺瘤(≥1cm)的敏感性為41.6%～58.4%,特異性為88.0%～96.4%,是結直腸癌早期診斷中潛在價值較高的標志物[24]。

表2 糞便樣本DNA甲基化對CRC的早期診斷

與糞便樣本中單基因甲基化標志物相比,多基因聯合檢測具有更大的優勢。Cologuard作為FDA批準的第一個用于多種生物標志物檢測的方法,包括對KRAS突變、異常NDRG4和BMP3甲基化、β-actin定量分子分析以及血紅蛋白免疫分析的檢測,具有較高的敏感性和特異性,它檢測結直腸癌和晚期癌前病變的敏感性分別為92.3%和42.4%,特異性為89.8%[25]。2018年,Cologuard被納入ACS更新的結直腸癌篩查指南[26]。Zhao等研究發現,相比于單獨檢測SEPT9或SDC2甲基化,糞便ColoDefense檢測對診斷結直腸癌顯示出更高的敏感性和特異性,分別為90.4%和91.9%,未來有可能成為一種低成本、方便、高效的結直腸癌早期檢測工具[27]。有研究顯示,在糞便樣本中使用COL4A2和TLX2甲基化組合能夠檢測到91.3%的結直腸癌和51.9%的晚期腺瘤,特異性為97.6%,這為糞便DNA檢測提供了更準確的甲基化標志物[24]。

3 尿液樣本DNA甲基化在結直腸癌早期診斷中的作用

循環腫瘤細胞DNA通過腎小球過濾經尿液排出,使尿液分析成為一種真正無創的癌癥檢測方法。目前關于尿液樣本中DNA甲基化檢測用于結直腸癌早期診斷的研究相對較少,但尿液作為一種生物液體,有其獨特的優勢。Xiao等在76例結直腸癌病例中開展研究,發現有55例尿液樣本NDRG4甲基化檢測為陽性,特異性為85%,提示NDRG4甲基化可以作為尿液樣本中用于結直腸癌診斷的候選生物標志物[28]。2021年,Bach等通過分析尿液中腫瘤來源的DNA甲基化片段來評估其檢測結直腸癌的可行性,對92例結直腸癌患者和63例健康對照者的尿液樣本進行DNA甲基化分析,結果顯示SEPT9作為結直腸癌檢測的潛在尿液生物標志物顯示出較好的準確性。與健康對照者相比,結直腸癌患者尿液上清液中SEPT9甲基化水平顯著升高(P<0.0001),SEPT9和SDC2組成的聯合診斷模型能夠檢測到尿液上清液中高達70%的結直腸癌病例,特異性為86%[29]。以上研究表明,尿液樣本DNA甲基化為結直腸癌無創篩查提供了一種具有應用潛力的工具。

4 腸道灌洗液樣本DNA甲基化在結直腸癌早期診斷中的作用

結直腸癌患者的腸道灌洗液(BLF) 中含有許多脫落的腫瘤細胞,這為腸道灌洗液中DNA甲基化標志物用于結直腸癌篩查和診斷提供了可行性[30,31]。2018年,Park等從結直腸腫瘤患者和健康個體中共收集了190例腸道灌洗液樣本,檢測其中SDC2甲基化的情況,結果顯示SDC2甲基化檢測結直腸癌和絨毛狀腺瘤的敏感性分別為80.0%和64.7%,特異性為88.9%[32]。上述研究表明,SDC2甲基化是癌前病變中常見的表觀遺傳修飾,并在腸道灌洗液樣本中顯示出具有診斷結直腸腫瘤的潛力。但是腸道灌洗液的效用依賴于成功的腸道準備,殘余糞便等因素可能會對腫瘤來源的DNA甲基化檢測產生干擾。因此,與其他需要進行腸道準備的結直腸癌檢查方法進行結合,可以提高腸道灌洗液樣本DNA甲基化檢測的應用效果。

5 結語

綜上,目前DNA甲基化標志物檢測作為結直腸癌一種非侵入性的檢測方法,在其早期篩查和診斷方面具有廣闊的前景和巨大的臨床應用潛力。同時,DNA甲基化標志物檢測也面臨著諸多挑戰,例如,不同樣本中的DNA甲基化標志物的檢測結果有時與結直腸癌組織中甲基化模式表現不一致;高質量的腸道灌洗液樣本依賴于良好的腸道準備,殘余糞便可能會對檢測結果造成一定程度的影響;以及尿液樣本和腸道灌洗液樣本的DNA甲基化用于結直腸癌早期診斷的大規模隊列研究和應用較少等。因此,新型DNA甲基化標志物的發現、DNA甲基化檢測新技術的研發及標志物檢測的質量控制等仍需進一步的探索。