原發(fā)性肝癌組織中層粘連蛋白3、黏著斑激酶蛋白表達(dá)及其與患者臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系研究

劉立友,吳東洋,蔡青山,鄭建興,李樹棟,劉 東

(唐山中心醫(yī)院肝膽外科,河北 唐山 063000)

原發(fā)性肝癌可導(dǎo)致肝功能衰竭和病死率的升高,盡管肝癌的診療水平有了很大提高,但患者預(yù)后仍然較差,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率依舊很高。因此,研究肝癌的發(fā)病機(jī)制及尋找特異性標(biāo)志物對(duì)肝癌患者的治療和預(yù)后具有積極作用[1-2]。層粘連蛋白3(Laminin 3,LAMA3)在胰腺癌、鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào),與腫瘤細(xì)胞的黏附和侵襲有關(guān)。有報(bào)道[3]顯示,LAMA3的異常表達(dá)可參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。黏著斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)是一種非受體型酪氨酸激酶,在胃癌和結(jié)腸癌中異常高表達(dá),可促進(jìn)腫瘤新生血管的形成和腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[4-5]。關(guān)于LAMA3、FAK與原發(fā)性肝癌關(guān)系的報(bào)道相對(duì)較少。因此,本研究探討原發(fā)性肝癌組織中LAMA3、FAK表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年11月至2020年2月于唐山中心醫(yī)院接受肝癌切除術(shù)治療的原發(fā)性肝癌患者75例,手術(shù)過程中采集癌組織和癌旁組織標(biāo)本。其中,男性45例,女性30例;年齡34～78歲,平均(58.70±9.50)歲,年齡<60歲38例,≥60歲37例;TNM分期[6]中,Ⅰ-Ⅱ期42例,Ⅲ-Ⅳ期33例;腫瘤直徑<5 cm者46例,≥5 cm者29例;甲胎蛋白(AFP)<400 U/ml者24例,≥400 U/ml者51例;乙肝表面抗原(HBsAg)陽性58例,HBsAg陰性17例;低、中分化40例,高分化35例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例;有血管侵犯32例,無血管侵犯43例。病例納入標(biāo)準(zhǔn):符合原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)病理學(xué)確診;首次確診;納入本研究前未接受其他治療;簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):合并血液系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重感染疾病;合并其他腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病;有其他重要器官疾病史;精神異常者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化法檢測組織LAMA3、FAK蛋白表達(dá):將癌組織和癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋并切片,經(jīng)烤片、常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化和抗原熱修復(fù)后,加入兔抗人LAMA3(1∶1500稀釋)、FAK(1∶2000稀釋)多克隆抗體(批號(hào):ab217213、ab131435,英國Abcam公司),以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。4 ℃孵育過夜,PBS洗滌后加入二抗(批號(hào):LF-2637,鄭州微颯生物科技有限責(zé)任公司),37 ℃孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色約2 min,蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水,中性樹膠封片。用已知LAMA3、FAK陽性切片作為陽性對(duì)照,顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.2.2 組織LAMA3、FAK蛋白檢測結(jié)果判讀:LAMA3、FAK蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。①按陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分:陽性細(xì)胞比例≤5%計(jì)0分,5%<陽性細(xì)胞比例≤25%計(jì)1分,25%<陽性細(xì)胞比例≤50%計(jì)2分,50%<陽性細(xì)胞比例≤75%計(jì)3分,>75%計(jì)4分。②根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分:無染色計(jì)0分,淺黃色計(jì)1分,棕黃色計(jì)2分,棕褐色計(jì)3分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘得分0～1分為陰性,≥2分為陽性[7]。

1.2.3 隨訪:術(shù)后隨訪3年,每3個(gè)月復(fù)查1次。隨訪從術(shù)后第1天截止到2023年2月28日,記錄患者生存情況,終點(diǎn)事件為死亡或到截止時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示,采用卡方檢驗(yàn);采用Kaplan-Meier生存曲線分析LAMA3、FAK蛋白表達(dá)與原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的關(guān)系;采用Logistic回歸分析原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的影響因素;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌組織和癌旁組織LAMA3、FAK蛋白表達(dá)比較 見表1(圖1)。肝癌組織LAMA3和FAK蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁組織(均P<0.05)。

圖1 原發(fā)性肝癌患者癌組織、癌旁組織LAMA3、FAK蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,×200)

2.2 肝癌組織LAMA3、FAK蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表2。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵犯的患者肝癌組織LAMA3、FAK蛋白陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無血管侵犯的患者(均P<0.05)。

2.3 肝癌組織LAMA3、FAK蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 見圖2。術(shù)后隨訪3年,生存患者35例,病死患者40例。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,肝癌組織LAMA3蛋白表達(dá)陽性患者3年累積生存率為36.00%(18/50),低于LAMA3蛋白表達(dá)陰性患者3年累積生存率68.00%(17/25)(χ2=6.857,P=0.009)。肝癌組織FAK蛋白表達(dá)陽性患者3年累積生存率為30.77%(12/39),低于FAK蛋白表達(dá)陰性患者3年累積生存率63.89%(23/36)(χ2=8.250,P=0.004)。

圖2 肝癌組織LAMA3(左)、FAK(右)蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 肝癌患者預(yù)后影響因素Logistic回歸分析 見表3。以肝癌患者術(shù)后3年內(nèi)是否病死為因變量(是=1,否=0),將年齡(≥60歲=1,<60歲=0)、性別(男性=1,女性=0)、TNM分期(Ⅲ-Ⅳ期=1,Ⅰ-Ⅱ期=0)、腫瘤直徑(≥5 cm=1,<5 cm=0)、AFP(≥400 U/ml=1,<400 U/ml=0)、HBsAg(陽性=1,陰性=0)、分化程度(低、中分化=1,高分化=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有=1,無=0)、血管侵犯(有=1,無=0)、LAMA3蛋白(陽性=1,陰性=0)、FAK蛋白(陽性=1,陰性=0)作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有血管侵犯、LAMA3蛋白陽性和FAK蛋白陽性是原發(fā)性肝癌患者術(shù)后3年預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。

表3 影響肝癌患者預(yù)后的Logistic回歸分析

3 討 論

LAMA3基因位于人18號(hào)染色體,是層粘連蛋白α亞單位的編碼基因,層粘連蛋白是由α、β和γ亞基組成的蛋白聚體,是構(gòu)成基底膜的主要成分,可影響細(xì)胞行為和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[8-9]。LAMA3的異常表達(dá)可影響層粘連蛋白的生物活性,與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[10]。研究[11]顯示,LAMA3在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào),且與患者的腫瘤大小、TNM分期顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,原發(fā)性肝癌患者癌組織LAMA3蛋白陽性表達(dá)率為66.67%,高于癌旁組織的28.00%,提示LAMA3與原發(fā)性肝癌的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵犯的患者肝癌組織中LAMA3蛋白陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵犯的患者,提示LAMA3可能參與原發(fā)性肝癌的進(jìn)展。LAMA3在肝癌中的作用機(jī)制可能與微小RNA的調(diào)控和甲基化有關(guān)。研究[12]顯示,LAMA3在卵巢癌中高度甲基化,可導(dǎo)致患者化療耐藥,進(jìn)而預(yù)后不良。Xu等[13]研究表明,靶向激活LAMA3可使得肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng),促進(jìn)肺腺癌惡性進(jìn)展。本研究推測LAMA3可能通過影響肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲而參與肝癌的進(jìn)展。

FAK是一種存在于細(xì)胞質(zhì)的非受體酪氨酸激酶,與腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖、遷移以及血管生長等多種生物學(xué)行為有關(guān)[14-16]。研究[17]發(fā)現(xiàn),激活FAK表達(dá)可促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和糖代謝。本研究結(jié)果顯示,原發(fā)性肝癌患者癌組織FAK蛋白陽性表達(dá)率為52.00%,顯著高于癌旁組織的18.67%。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵犯的患者肝癌組織中FAK蛋白陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵犯的患者,提示FAK與原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。本研究推測FAK在原發(fā)性肝癌中通過細(xì)胞黏附作用影響肝癌細(xì)胞遷移與侵襲,進(jìn)而影響肝癌的進(jìn)展。研究[18]顯示,在人肝癌細(xì)胞中下調(diào)FAK表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞黏附、遷移和侵襲能力。目前有關(guān)靶向FAK的抑制劑已有報(bào)道,如姚紅兵等[19]研究表明,FAK抑制劑CT-707可減弱肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力,抑制腫瘤生長。

LAMA3、FAK表達(dá)還與癌癥患者預(yù)后相關(guān)。王維杰等[20]研究表明,LAMA3高表達(dá)胰腺癌患者5年生存率顯著低于LAMA3低表達(dá)患者,LAMA3是胰腺癌的不良預(yù)后因素。另有研究[21]顯示,FAK的過表達(dá)及其磷酸化可顯著縮短骨肉瘤患者總生存時(shí)間和無轉(zhuǎn)移生存時(shí)間。本研究顯示,肝癌組織中LAMA3、FAK蛋白表達(dá)陽性患者3年累積生存率顯著低于LAMA3蛋白表達(dá)陰性患者,提示LAMA3、FAK可能通過影響肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲而參與肝癌的進(jìn)展,影響患者預(yù)后。本研究還發(fā)現(xiàn),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有血管侵犯、LAMA3蛋白陽性和FAK蛋白陽性是原發(fā)性肝癌患者術(shù)后3年預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示LAMA3、FAK蛋白可能能夠作為預(yù)測原發(fā)性肝癌患者不良預(yù)后的標(biāo)志物。在臨床上,對(duì)較易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行LAMA3、FAK蛋白檢測,對(duì)高表達(dá)患者密切關(guān)注和及早干預(yù),可提高患者生存率。然而,LAMA3、FAK蛋白在原發(fā)性肝癌中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,原發(fā)性肝癌組織中LAMA3、FAK蛋白呈高表達(dá),且兩者陽性表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及預(yù)后有關(guān),可能作為原發(fā)性肝癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物。