低密度脂蛋白相關受體蛋白6基因多態性與非酒精性脂肪性肝病發病關系研究

梁 娜,張澤天,孫曉冉,李 多

(河北北方學院附屬第一醫院消化內科,河北 張家口 075000)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是與胰島素抵抗及遺傳易感性有密切聯系的肝臟代謝綜合征。NAFLD也與脂肪代謝密切相關,其臨床表現與酒精性肝病相近,但患者通常無過量飲酒史[1-2]。目前,NAFLD發病率增長迅速,且呈低齡化發展,嚴重威脅人類生命健康[3-4]。低密度脂蛋白相關受體蛋白6(Low-density lipoprotein receptor-related protein 6,LRP6)是LRP家族成員,在脂質轉運方面發揮重要作用[5]。王秀梅等[6]研究顯示,微小RNA-21可通過LRP6等靶標參與NAFLD及其相關并發癥的發生和發展。目前,關于NAFLD與LRP6基因相關性的報道較少。因此,本研究選取LRP6基因作為候選基因,以NAFLD患者為研究對象,探討LRP6基因在rs2302685位點的多態性與NAFLD發病的關系,為進一步闡明NAFLD的發病機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年5月至2022年12月于河北北方學院附屬第一醫院就診的NAFLD患者144例為NAFLD組,其中男性82例,女性62例;年齡29～57歲,平均(43.04±10.32)歲;體重指數(BMI)20.35～28.13 kg/m2,平均(24.36±2.23)kg/m2。病例納入標準:符合NAFLD診斷標準[7];未伴有藥物性脂肪肝、慢性病毒性肝病以及自身免疫性肝病者;臨床資料保存完整;漢族人群。排除標準:伴有惡性腫瘤及心、肺、腎等臟器病變者;有酒精濫用史者;伴有內分泌疾病及其他遺傳性疾病者。選取同期體檢健康者135例為對照組,其中男性80例,女性55例;年齡30～55歲,平均(42.96±9.87)歲;BMI 19.70～25.91 kg/m2,平均(22.94±2.38)kg/m2。本研究經醫院倫理委員會批準,受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 基因組DNA提取試劑盒(批號:BM15830,廈門萬泰滄海生物科技公司);Taq DNA聚合酶(批號:RE0110-0.5kU,北京金克隆生物技術有限公司);dNTP溶液(批號:BTN51208C-WDL,泉州睿信生物科技有限公司)。紫外分光光度計(型號:Nano Drop One,美國Thermo Fisher公司);全自動生化分析儀(型號:URIT-8020A,福州飛凈生物科技有限公司);凝膠成像儀(型號:D56-26M,美國Bio-Rad公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集和保存:抽取受試者清晨空腹靜脈血8 ml,以7700 r/min離心15 min,收集上層血清,迅速置于-70 ℃環境中保存。

1.3.2 生化指標檢測:取部分血清樣本,采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、載脂蛋白B(ApoB)以及ApoA1。

1.3.3 LRP6基因型檢測:取血清樣本,采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA,紫外分光光度計測定純度及濃度。PCR反應體系:氯化鎂(MgCl2)1.5 μl,PCR緩沖液2.5 μl,dNTP 2.0 μl,上下游引物各0.5 μl,DNA模板2.0 μl,Taq DNA聚合酶0.2 μl,ddH2O 15.8 μl。PCR反應條件:96 ℃ 4 min;93 ℃ 19 s,59 ℃ 21 s,共43個循環;76 ℃ 6 min。rs2302685正向引物序列為5’-ATAAGACCGTTGCTGCCTGAT-3’,反向引物序列為5’-TATGTTAATAATCCTTGGTGC-3’。取10 μl產物電泳后,凝膠成像儀觀察結果并拍照。任取多個含3種基因型的單一、明亮特異性條帶PCR產物,純化后送至北京華大基因公司測序,采用Chromas軟件進行測序結果比對,尋找基因突變位點。

2 結 果

2.1 兩組一般資料和生化指標比較 見表1。對照組和NAFLD組性別、年齡、AST、TC、HDL-C、ApoA1比較,差異無統計學意義(均P>0.05)。NAFLD組BMI、ALT、TG、LDL-C、ApoB水平高于對照組(均P<0.05)。

表1 兩組一般資料和生化指標比較

2.2 兩組LRP6基因rs2302685位點基因型分布比較 見表2。對照組和NAFLD組LRP6基因在rs2302685位點上均檢出TT型、TC型和CC型3種基因型。對照組TT基因型最多(57.78%),CC基因型最少(8.89%),T等位基因為201(74.44%),C等位基因為69(25.56%);NAFLD組CC基因型最多(56.94%),TT基因型最少(10.42%),T等位基因為77(26.74%),C等位基因為211(73.26%)。對照組與NAFLD組基因型比較差異有統計學意義(χ2=94.657,P=0.000)。經吻合度檢驗,對照組和NAFLD組基因多態性分布符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡法則(χ2=2.074、4.009,P=0.355、0.135),表明對所選樣本進行群體遺傳學研究具有代表性。

表2 兩組LRP6基因rs2302685位點基因型分布比較[例(%)]

2.3 不同LRP6基因型NAFLD患者生化指標比較 見表3。TT型、TC型、CC型NAFLD患者BMI、ALT、TG、LDL-C以及ApoB水平依次升高(均P<0.05)。

表3 不同LRP6基因型NAFLD患者生化指標比較

2.4 LRP6基因型對NAFLD發生的影響Logistic回歸分析 見表4。將是否發生NAFLD作為因變量,校正性別、年齡、BMI、ALT、AST、TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoB和ApoA1等混雜因素后,以LRP6基因的三種基因型(TT型、TC型、CC型)為自變量,行Logistic回歸分析,結果顯示CC基因型是影響NAFLD發生的獨立危險因素(P<0.05)。

表4 LRP6基因型對NAFLD發生的影響Logistic回歸分析

3 討 論

隨著人們生活方式的轉變以及代謝綜合征在全球的流行,NAFLD是愈發受到重視的慢性肝病[8-9]。其發病率在世界范圍內逐年上升,且流行與肥胖有關。NAFLD能夠預防,但由于患病基數大,已逐漸對公共衛生構成較大的挑戰。在沒有酒精攝入下,過量脂質在肝臟中累積會誘發NAFLD。NAFLD能引起肝功能異常,甚至引發肝炎、肝硬化等疾病,其中代謝因素在肝脂肪變性中起到重要作用[10-11]。近年來,運動及一些藥物的使用可在一定程度上緩解NAFLD,但這些治療方式仍然具有局限性,同時一些藥物也有一定的毒性[12-13]。本研究結果顯示,NAFLD組BMI、ALT、TG、LDL-C、ApoB水平高于對照組,提示NAFLD的發生與代謝組分的升高關系密切。

NAFLD的一些致病因素,如基因多態性,已成為深入實驗研究的基礎,對NAFLD的發病具有調控作用[14-16]。Dai等[17]研究發現,patatin樣磷脂酶結構域3基因rs738409位點多態性不僅是NAFLD易感性的重要因素,而且與疾病嚴重程度有關。姜華等[18]研究結果顯示,肝性脂肪酸結合蛋白是肝臟脂質代謝的重要調節因子,其基因多態性與NAFLD顯著相關。

LRP分布于哺乳動物的肝臟動脈壁平滑肌細胞、血管內皮細胞等,其中肝細胞含量最多[19-21]。研究[22]表明,LRP6通過Wnt相關信號通路,使得哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路激活,從而影響脂質合成。LRP6可通過影響脂質轉運參與動脈粥樣硬化的發生,且LRP6變異影響家族性高膽固醇血癥的發生[23-24]。因此,LRP6與脂質代謝密切相關,但與脂肪性肝病發病機制的關系仍不明確,相關報道較少,且漢族人群LRP6多態性與NAFLD的關系需進一步研究。本研究結果顯示,納入的漢族人群中存在LRP6基因rs2302685位點多態性,主要包括TT型(野生型)、TC型(突變雜合子)以及CC型(突變純合子)3種基因型,且3種基因型的分布在NAFLD組和對照組中有差異。其中,對照組TT基因型最多(57.78%),NAFLD組CC基因型最多(56.94%)。提示NAFLD患者C等位基因比例較大,rs2302685位點等位基因C與NAFLD的發病關系密切。本研究發現,CC基因型是影響NAFLD發生的獨立危險因素,攜帶LRP6基因rs2302685位點CC基因型的個體患NAFLD的風險是攜帶TT基因型個體的2.643倍。此外,本研究結果中CC型NAFLD患者BMI、ALT、TG、LDL-C、ApoB水平高于TT型和TC型NAFLD患者,提示LRP6基因rs2302685位點CC基因型攜帶者出現血脂水平異常或肝臟功能異常的風險增加。

綜上所述,LRP6基因rs2302685位點多態性與NAFLD相關,且CC基因型是影響NAFLD發生的獨立危險因素。但因本研究所選樣本均來自同一家醫院,納入對象比較單一,而不同地區人群間可能有較大差異,故需進一步進行多中心大樣本量的研究。此外,本研究中選取的LRP6基因rs2302685位點與脂質代謝相關疾病的研究相對不足,細胞模型、動物模型以及人群研究均相對缺乏,也需要后續更多研究加以完善。