特應(yīng)性皮炎患兒血清長鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3和微小RNA-23b-3p水平檢測及意義

劉 巖,凌琬茗,趙瑞雪,王 浩,程 毅

(1.河北省兒童醫(yī)院皮膚科,河北 石家莊 050030;2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科,河北 石家莊 050000)

特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是常見的慢性炎癥性皮膚病,主要表現(xiàn)為多形性皮損如紅斑、丘疹、滲出以及瘙癢等,多見于兒童和青少年[1-3]。研究[4]表明,皮膚屏障功能障礙、免疫失調(diào)、遺傳、環(huán)境及感染等多種因素可影響AD的病理生物學(xué)。研究[5]發(fā)現(xiàn),長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)通過轉(zhuǎn)錄等不同機(jī)制參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞發(fā)育、免疫反應(yīng)和細(xì)胞代謝等多種細(xì)胞功能。其中,lncRNA母系表達(dá)基因3(Maternal expression gene 3,MEG3)在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中表達(dá)降低,其過表達(dá)可以降低炎癥反應(yīng),抑制軟骨細(xì)胞凋亡[6]。微小RNA(microRNA,miR)是小的內(nèi)源性非編碼RNA,與基因的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合,可通過影響靶基因的翻譯調(diào)控基因表達(dá)[7]。miR-23b-3p位于人類染色體9q22.32區(qū)域,有900個堿基對,與炎癥相關(guān)反應(yīng)關(guān)系密切[8]。但miR-23b-3p是否參與AD的發(fā)展尚不清楚。因此,本研究以兒童AD患者為研究對象,分析患兒血清中l(wèi)ncRNA MEG3、miR-23b-3p表達(dá)與兒童AD嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年9月至2023年2月于河北省兒童醫(yī)院就診的AD患兒165例為AD組,其中男性85例,女性80例;年齡2～14歲,平均(8.46±2.59)歲;病程3.26～12.15個月,平均(7.81±2.45)個月。病例納入標(biāo)準(zhǔn):符合AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];近1個月未使用免疫抑制劑、抗生素及糖皮質(zhì)激素;無家族遺傳史和其他基礎(chǔ)疾病;患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):合并自身免疫性疾病或可疑慢性疾病者;已經(jīng)接受醫(yī)院治療方案且不愿意配合本次研究者;主要臟器如肝、腎、心和肺等存在疾病者。另選取同期體檢健康兒童160例為對照組,其中男性85例,女性75例;年齡2～14歲,平均(8.54±2.76)歲。AD組和對照組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol試劑(批號:QY485-05)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:QY275-99)、PCR試劑盒(批號:QY582-94)購自保定盛谷生物科技有限公司;熒光定量PCR儀(型號:Esan-Gene 696)購自濟(jì)南思科生物科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血清lncRNA MEG3和miR-23b-3p水平檢測:采集AD組入院24 h內(nèi)和對照組空腹靜脈血5 ml,靜置11 min,4 ℃下3800 r/min離心13 min,收集血清。采用TRIzol試劑提取各血清樣本總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以此為模板使用熒光定量PCR法檢測血清中l(wèi)ncRNA MEG3和miR-23b-3p水平。其中,lncRNA MEG3以GAPDH為內(nèi)參,miR-23b-3p以U6為內(nèi)參,引物(由揚州芙萊瑞生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成)序列見表1。反應(yīng)體系共30 μl:cDNA 2 μl、緩沖液5 μl、dNTP 4 μl、上下游引物各1 μl、DNA聚合酶1 μl、ddH2O 16 μl。反應(yīng)程序:93 ℃預(yù)變性6 min; 93 ℃ 10 s,55 ℃ 29 s,72 ℃ 19 s,進(jìn)行36個循環(huán);72 ℃延伸4 min。使用相對基因定量法(2-ΔΔCt法)計算lncRNA MEG3和miR-23b-3p水平。

表1 各基因引物序列

1.3.2 AD患兒疾病嚴(yán)重程度評估及分組:根據(jù)AD積分指數(shù)(AD Integral Index,SCORAD)[9]對AD患兒疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行評估。評估內(nèi)容包括:①皮損面積記為A,根據(jù)不同年齡段皮損面積評判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行皮損面積判定,以1%面積為1分;②皮膚損傷嚴(yán)重程度記為B,共包括6項體征,評分標(biāo)準(zhǔn)(皮損程度由輕到重)為0～3四級評分法;③瘙癢、睡眠障礙程度記為C,按最近3晝夜來評分(平均分),每項均0～10分。SCORAD總分0～103分。根據(jù)SCORAD評分(計算公式為A/5+7B/2+C)將165例AD患兒分為AD輕度組(評分<25分,65例)、AD中度組(25分≤評分≤50分,68例)和AD重度組(評分>50分,32例)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患兒血清lncRNA MEG3和miR-23b-3p水平比較 見表2。與對照組比較,AD組血清lncRNA MEG3和miR-23b-3p水平降低(均P<0.05)。

表2 兩組患兒血清lncRNA MEG3和miR-23b-3p水平比較

2.2 不同嚴(yán)重程度AD患兒一般資料及血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p水平比較 見表3。與AD輕度組比較,AD中度組和AD重度組血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p水平依次降低,SCORAD評分依次升高(均P<0.05)。

表3 不同嚴(yán)重程度AD患兒一般資料及血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p水平比較

2.3 AD組患兒血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p水平和SCORAD評分的相關(guān)性 Pearson分析結(jié)果顯示,AD組血清lncRNA MEG3與miR-23b-3p水平呈正相關(guān)(r=0.404,P<0.05)。血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p水平與SCORAD評分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.383、-0.366,均P<0.05)。

2.4 血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p單項及聯(lián)合檢測對中度AD的診斷價值 見表4。ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p單項及聯(lián)合檢測診斷中度AD的AUC分別均較高。與血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p單獨檢測比較,兩者聯(lián)合檢測診斷中度AD的AUC更高(Z=2.177、3.595,均P<0.05)。

表4 血清LncRNA MEG3、miR-23b-3p單項及聯(lián)合檢測對中度AD的診斷價值

2.5 血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p單項及聯(lián)合檢測對重度AD的診斷價值 見表5。ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p單項及聯(lián)合檢測診斷重度AD的AUC均較高。與血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p單獨檢測比較,兩者聯(lián)合檢測診斷重度AD的AUC更高(Z=2.104、2.293,均P<0.05)。

表5 血清LncRNA MEG3、miR-23b-3p單項及聯(lián)合檢測對重度AD的診斷價值

3 討 論

AD是一種以皮膚持續(xù)瘙癢為特征的復(fù)發(fā)性、慢性和非感染性的炎癥性皮膚病[10]。其主要發(fā)生在兒童中,發(fā)生率高達(dá)20%,且近幾十年來發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[11]。AD的發(fā)病機(jī)制目前還沒有明確,所以對該疾病無法進(jìn)行有效的治療,導(dǎo)致疾病遷延。若患者長期得不到有效治療,復(fù)發(fā)性或慢性炎癥可誘發(fā)皮膚苔蘚化或增厚,且該疾病治療負(fù)擔(dān)較重,對生活質(zhì)量影響巨大,尤其是中度和重度AD[12]。因此,準(zhǔn)確地診斷和評估AD的嚴(yán)重程度對于確定最佳治療策略至關(guān)重要。

lncRNA是長度超過200 nt的轉(zhuǎn)錄本,其異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)展有關(guān)。MEG3是lncRNA家族中高度保守的一員。研究[13]發(fā)現(xiàn),lncRNA MEG3參與多種腫瘤的發(fā)生。Gao等[14]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA MEG3在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中呈低表達(dá),lncRNA MEG3過表達(dá)通過糖原合成酶激酶3β促進(jìn)β-連環(huán)蛋白的降解,進(jìn)而使Wnt通路失活,最終抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性。Ye等[15]研究發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中l(wèi)ncRNA MEG3也呈低表達(dá),上調(diào)其表達(dá)能抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖、遷移和侵襲。值得注意的是,lncRNA MEG3在炎癥中也顯示出關(guān)鍵作用。lncRNA MEG3在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中表達(dá)降低,有望作為新的診治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的靶點[16]。何秀等[17]研究發(fā)現(xiàn),在脂多糖誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平顯著降低,上調(diào)lncRNA MEG3表達(dá)可以抑制炎癥因子分泌和細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA MEG3的升高能夠緩解潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組比較,AD組血清lncRNA MEG3水平明顯降低,且隨AD病情嚴(yán)重程度的升高而降低。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,AD組血清lncRNA MEG3水平與SCORAD評分呈負(fù)相關(guān),表明lncRNA MEG3可能參與兒童AD疾病的發(fā)生、發(fā)展,與AD的嚴(yán)重程度有關(guān),可能因為lncRNA MEG3低表達(dá)會加重AD的炎癥反應(yīng),使得患者病情加重。

微小RNA是大小為19～25個核苷酸的非編碼RNA,通過與靶基因微小RNA的3’UTR結(jié)合來抑制基因表達(dá),在多種生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[19-20]。miR-23b-3p是miR-23家族的成員,上調(diào)miR-23b-3p水平可改善肺炎鏈球菌導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞炎癥,改善細(xì)胞損傷。在免疫球蛋白A腎病患者的腎組織和血清中miR-23b-3p表達(dá)水平顯著下調(diào),且miR-23b-3p水平越低,腎纖維化和腎損害越嚴(yán)重。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),AD組血清miR-23b-3p水平較對照組顯著降低,且AD嚴(yán)重程度越高,其水平越低。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,miR-23b-3p與SCORAD評分呈負(fù)相關(guān),表明miR-23b-3p水平與兒童AD的發(fā)病和疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。可能原因是,miR-23b-3p參與調(diào)控AD所涉及的炎癥因子活性,進(jìn)而影響AD病情。此外,本研究進(jìn)一步探究了血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p單項及聯(lián)合檢測診斷中、重度AD的效能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者單項檢測對中度、重度AD均有一定的診斷價值,且聯(lián)合檢測診斷效果更好,提示血清lncRNA MEG3、miR-23b-3p或可成為評估AD患兒病情嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。

綜上所述,在AD患兒血清中,lncRNA MEG3、miR-23b-3p水平呈低表達(dá),與病情嚴(yán)重程度有關(guān),有望成為評估兒童AD病情程度的生物標(biāo)志物。