膽管癌患者血清長鏈非編碼RNA母系表達基因3表達及其與預后相關性研究

趙東志,常媛媛,曹哲麗,李國東,趙雅娟

(保定市第一中心醫院消化內科,河北 保定 071000)

膽管癌屬惡性腫瘤的一種,起源于膽管上皮細胞,其病理生理機制尚不清楚,因此臨床尚未找到有效的針對性治療手段。當前膽管癌最有效治療手段為手術,但其早期臨床癥狀并不明顯,多數患者因此未能及時就醫,確診時已錯過最佳手術時機,導致患者生存率低,復發率高,預后較差[1-3]。相關研究發現,膽管癌的發病與多種基因的失調有一定聯系,其中長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)與膽管癌的病理生理過程密切相關。lncRNA起初被認為是基因組轉錄的“噪音”,不具有生物學功能,然而近年來發現lncRNA在轉錄、拼接等過程中發揮重要作用,并影響腫瘤的惡性進展過程[4-6]。雖然關于lncRNA的研究進展迅猛,但是絕大部分lncRNA的功能仍然未了解清楚。母系表達基因3(Maternally expressed gene 3,MEG3)是一種印記基因,編碼與腫瘤發生相關的lncRNA,可作為一個新型的lncRNA腫瘤抑制因子[7-8]。目前有關血清lncRNA MEG3與膽管癌關系的研究報道較少。因此,本研究通過檢測膽管癌患者血清lncRNA MEG3水平,分析其與患者預后的關系,初步探討血清lncRNA MEG3水平在膽管癌中的作用,以期為膽管癌的臨床診療及預后評估提供一定理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年12月至2020年3月于保定市第一中心醫院就診的膽管癌患者92例為研究對象(膽管癌組),患者均行根治性切除術治療。其中,男性47例,女性45例;年齡48～71歲,平均(59.51±6.43)歲;體重指數(BMI)17.13～23.92 kg/m2,平均(19.54±2.39)kg/m2;腫瘤部位中,肝門及肝內膽管55例,膽管中下段37例;腫瘤直徑<3 cm者62例,≥3 cm者30例;中高分化58例,低分化34例;TNM分期中,Ⅰ-Ⅱ期61例,Ⅲ期31例;有淋巴結轉移49例,無淋巴結轉移43例;有血管浸潤47例,無血管浸潤45例。病例納入標準:患者均符合膽管癌診斷標準[9],且經病理檢查確診;均為初次確診患者;所有患者均具有完整的隨訪資料。排除標準:合并嚴重心、腎、腦等重要臟器功能不全者;糖尿病、自身免疫系統疾病或妊娠期女性;不能配合者。選擇同期體檢健康者92例為對照組,其中男性51例,女性41例;年齡45～72歲,平均(58.87±6.90)歲;BMI 18.05～24.11 kg/m2,平均(20.14±2.05)kg/m2。膽管癌組和對照組性別、年齡、BMI比較差異無統計學意義(均P>0.05)。本研究在醫院倫理委員會批準下進行,受試者均對本研究知情同意,并簽訂協議書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集:采集受試者空腹靜脈血5 ml(膽管癌患者入院后24 h內,體檢健康者體檢時),4 ℃下以3700 r/min離心16 min分離血清,于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2.2 血清lncRNA MEG3表達水平檢測:取血清樣本,采用TRIzol試劑(批號:SL20941,杭州賽瀾生物技術有限公司)提取血清中總RNA,采用反轉錄試劑(批號:SL57192,杭州賽瀾生物技術有限公司)得到cDNA,以此為模板進行熒光定量PCR反應(試劑盒批號:HJ-1064R,湖南遠泰生物技術有限公司),以GAPDH為內參,反應體系共20 μl:PCR試劑10 μl,cDNA 4 μl,正、反向引物各1 μl,ddH2O 4 μl。反應程序:92 ℃預變性60 s;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環后,72 ℃延伸10 min。引物由深圳世立基因生物有限公司設計合成,以2-ΔΔCt法計算血清中lncRNA MEG3相對表達量。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.3 預后隨訪 以門診與電話相結合的方式進行隨訪,隨訪時間36個月,無失訪。以術后第1天為隨訪起始日期,以患者死亡(癌癥原因)或期滿為截止日。根據預后情況分為預后不良組(44例,患者死亡)和預后良好組(48例,患者存活)。

2 結 果

2.1 膽管癌組與對照組患者血清lncRNA MEG3表達水平比較 膽管癌組血清lncRNA MEG3表達水平顯著低于對照組(0.62±0.08與1.00±0.03,t=42.660,P<0.05)。

2.2 預后良好組與預后不良組患者臨床資料及病理特征比較 見表2。預后良好組和預后不良組年齡、性別、BMI、腫瘤部位、腫瘤直徑比較差異無統計學意義(均P>0.05)。預后不良組腫瘤低分化、TNM分期Ⅲ期、有淋巴結轉移、有血管浸潤比例高于預后良好組(均P<0.05)。

2.3 預后良好組與預后不良組患者血清lncRNA MEG3表達水平比較 預后不良組血清lncRNA MEG3表達水平顯著低于預后良好組(0.41±0.05與0.81±0.11,t=22.110,P<0.05)。

2.4 膽管癌患者血清lncRNA MEG3表達水平與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、血管浸潤相關性分析 膽管癌患者血清lncRNA MEG3表達水平與腫瘤分化程度呈正相關,與TNM分期、淋巴結轉移、血管浸潤均呈負相關(r=0.522、-0.625、-0.680、-0.549,均P<0.05)。

2.5 膽管癌患者預后不良影響因素Logistic回歸分析 見表3。以膽管癌患者是否預后不良(否=0,是=1)為因變量,以腫瘤分化程度(中高分化=0,低分化=1)、TNM分期(Ⅰ-Ⅱ期=0,Ⅲ期=1)、淋巴結轉移(無=0,有=1)、血管浸潤(無=0,有=1)及血清lncRNA MEG3(連續變量)為自變量,進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示,腫瘤低分化、TNM分期Ⅲ期、有淋巴結轉移以及血清lncRNA MEG3低表達是膽管癌患者預后不良的獨立危險因素(均P<0.05)。

表3 膽管癌患者預后不良影響因素Logistic回歸分析

2.6 血清lncRNA MEG3對膽管癌患者預后不良的預測價值 見圖1。ROC曲線分析結果顯示,血清lncRNA MEG3預測膽管癌患者預后不良的曲線下面積為0.820(95%CI:0.683～0.957),截斷值為0.620,敏感度為87.10%,特異度為70.80%。

圖1 血清lncRNA MEG3對膽管癌患者預后不良的預測價值ROC曲線

3 討 論

膽管癌發生率呈逐年升高趨勢,病因不明,起病隱匿,惡性程度較高,目前尚缺乏高靈敏度和特異度的生物學標志物用于診斷,大多患者確診時往往已處于晚期,因此很難做到早期診斷和預后評估,目前其治療手段以手術為主,以放化療為輔,但預后在通常情況下較差,復發率高[10-12]。因此,需要尋找影響膽管癌預后的敏感生物學標志物以評估預后。

lncRNA廣泛存在于生物體內并參與許多生理、病理進程,具有多種調控功能,且能夠介導多種腫瘤的發生與發展[13-15]。近年來,隨著基因工程學與生物信息學的發展,越來越多的研究[16-18]表明,lncRNA參與癌基因的表達,在多種腫瘤中的重要作用不斷被揭示,其在結腸癌等許多消化系統惡性腫瘤中都存在功能異常,且與腫瘤預后有關。研究[19-21]顯示,lncRNA在膽管癌患者非正常組織(腫瘤組織)中的表達與其在正常組織中的表達有巨大差異,lncRNA可能確實參與了膽管癌的發生,而在癌癥患者的癌癥組織中出現異常表達的lncRNA或許可以作為膽管癌早期診斷或預后評估的重要生物學標志物。

lncRNA MEG3定位于人染色體14q32.3,是一種具有抑癌作用的lncRNA,在癌組織中可能低表達,而高表達于正常人類組織,可通過抑制腫瘤血管生成阻止腫瘤惡性進展。有研究[8,22]報道,lncRNA MEG3可發揮抑癌基因作用,在腫瘤組織中表達缺失,這種異常的缺失可能參與腫瘤新血管的部分生成過程,并發展為促腫瘤的惡性作用,并且lncRNA MEG3含量的異常變化或許與腫瘤細胞的增殖呈負相關,即lncRNA MEG3高表達可能對腫瘤細胞增殖的抑制具有重要作用,且lncRNA MEG3低表達患者預后較差。徐瀚斌等[23]研究表明,在胃癌組織中lncRNA MEG3表達降低,而lncRNA MEG3表達降低預示著胃癌患者病情惡化及較差的預后。本研究結果顯示,膽管癌患者血清lncRNA MEG3表達水平較健康人低,表明lncRNA MEG3參與膽管癌的發生。本研究還發現,預后不良組腫瘤低分化、TNM分期Ⅲ期、有淋巴結轉移、有血管浸潤比例均顯著高于預后良好組,血清lncRNA MEG3表達水平顯著低于預后良好組,且膽管癌患者血清lncRNA MEG3表達水平與腫瘤分化程度呈正相關,與TNM分期、淋巴結轉移、血管浸潤均呈負相關,提示血清lncRNA MEG3低表達與膽管癌患者病情進展和不良預后有關,其表達水平降低可能促進腫瘤血管生成,繼而參與了腫瘤患者病情的不良發展,與患者預后不良有關。本研究還顯示,腫瘤低分化、TNM分期Ⅲ期、有淋巴結轉移、血清lncRNA MEG3低表達是膽管癌患者預后不良的獨立危險因素,表明血清lncRNA MEG3可能通過影響腫瘤細胞增殖等過程參與膽管癌進展,進而影響患者預后。ROC曲線分析結果表明,血清lncRNA MEG3水平對膽管癌患者的預后不良具有一定的預測價值,其可能用于膽管癌患者預后的評估。

綜上所述,膽管癌預后不良患者血清lncRNA MEG3表達降低,是影響膽管癌患者預后的重要因素,對膽管癌患者的預后不良具有一定的預測價值,可能是評估膽管癌患者預后的潛在參考指標。但lncRNA MEG3在膽管癌進展及預后中的作用是一個復雜的過程,其具體作用機制仍需進一步研究。