桃葉珊瑚苷對膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠的作用及機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究

夏紅麗,田俊斌,李治琴

(1.西安市第三醫(yī)院,陜西 西安 710021;2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院,陜西 西安 710004)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是老年患者殘疾的重要原因,嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量[1]。自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要途徑[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎調(diào)肝方含藥血清增強(qiáng)軟骨細(xì)胞自噬能力,延緩大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變,起到治療KOA的作用。研究[4]表明,激活自噬可在一定程度上延緩KOA進(jìn)展。桃葉珊瑚苷是環(huán)烯醚萜苷類化合物,杜仲所含天然活性成分之一。研究[5]表明,桃葉珊瑚苷可通過誘導(dǎo)自噬抑制成骨細(xì)胞凋亡。研究[6]發(fā)現(xiàn),桃葉珊瑚苷可在體外抑制白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡,在體內(nèi)延緩KOA小鼠病程進(jìn)展。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Phosphatidylinositol 3-kinases/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)信號通路是細(xì)胞自噬的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究[7]表明,PI3K/AKT/mTOR信號通路在KOA大鼠軟骨組織中異常活化,續(xù)斷總皂苷通過抑制該信號通路上調(diào)軟骨細(xì)胞自噬水平,延緩KOA進(jìn)展。但關(guān)于桃葉珊瑚苷能否通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬改善KOA的相關(guān)報(bào)道較少。因此,本研究探討桃葉珊瑚苷對KOA小鼠的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性C57小鼠50只,7周齡,體重(22±2)g,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2017-0005。所有小鼠飼養(yǎng)于溫度(23±2)℃、空氣濕度50%～60%、12 h明暗交替的環(huán)境中,自由進(jìn)食和飲水。

1.2 主要試劑 桃葉珊瑚苷(批號:SA9840,純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司);PI3K/AKT/mTOR信號通路激動劑740Y-P(批號:S80211,上海源葉生物科技有限公司);IL-6檢測試劑盒(批號:PI326,上海碧云天生物科技有限公司);IL-1β檢測試劑盒(批號:BMS6002,北京諾為生物);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒(批號:SPS-31517,上海賽培森生物科技有限公司);自噬相關(guān)蛋白(Atg5、Atg12、Baclin-1、LC3 Ⅱ/Ⅰ)及p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR和GAPDH抗體(批號:ab108327、ab303488、ab207612、ab192890、ab278545、ab302958、ab38449、ab8805、ab109268、ab134903、ab8245,美國Abcam公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與模型制備:將50只小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、桃葉珊瑚苷組、激動劑組、桃葉珊瑚苷+激動劑組,每組10只。除正常對照組外,其余組小鼠根據(jù)改良的Hulth法[8]建立KOA模型。小鼠腹腔麻醉,縱行切開右后肢膝關(guān)節(jié)部位皮膚,暴露膝關(guān)節(jié),離斷前、后交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶,打開關(guān)節(jié)腔,切除內(nèi)側(cè)2/3半月板,止血后逐層縫合。正常對照組小鼠采用同樣的操作暴露關(guān)節(jié)腔,不離斷前、后交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶,不切除半月板。術(shù)后肌注青霉素抗感染。

1.3.2 給藥與取材:造模后第2天,桃葉珊瑚苷組80 mg/kg[6]桃葉珊瑚苷灌胃,1次/d,連續(xù)12周;激動劑組腹腔注射740Y-P 0.5 μmol/kg[9],1次/d,連續(xù)12周;桃葉珊瑚苷+激動劑組80 mg/kg桃葉珊瑚苷灌胃,同時(shí)0.5 μmol/kg 740Y-P腹腔注射,1次/d,連續(xù)12周;正常對照組和模型組小鼠分別灌胃和腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液,1次/d,連續(xù)12周。于末次給藥2 h后處死小鼠,采集右后肢膝關(guān)節(jié)軟骨組織,分成4份,其中1份進(jìn)行乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)脫鈣處理4周,4%多聚甲醛固定,其余3份置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 HE染色:取經(jīng)4%多聚甲醛固定后組織,經(jīng)脫水、包埋、石蠟切片、伊紅染液染色、雙蒸水沖洗、蘇木素染液染色、雙蒸水清洗、中性樹膠封片后,于顯微鏡下觀察小鼠膝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)變化,并進(jìn)行Mankin評分。其中,軟骨表面損傷計(jì)0～6分,細(xì)胞喪失計(jì)0～3分,基質(zhì)染色喪失計(jì)0～4分,潮線喪失計(jì)0～1分,分值越高表明病變越嚴(yán)重[10]。

1.3.4 番紅O-固綠染色:取石蠟切片,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行染色。

1.3.5 軟骨組織炎癥因子水平檢測:取凍存的軟骨組織,剪碎,勻漿后3000 r/min離心10 min,取上清液,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測自噬相關(guān)基因、PI3K、AKT和mTOR mRNA水平:取凍存的軟骨組織,剪碎,勻漿后采用TRIzol試劑提取組織RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板行PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參,引物由廣州銳博生物科技有限公司合成,序列見表1。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。

表1 各基因引物序列

1.3.7 蛋白印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白、LC3 Ⅱ/Ⅰ、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白水平:取凍存的軟骨組織,剪碎,勻漿,裂解,BCA法測定蛋白濃度。蛋白電泳分離,取下分離膠,將分離膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,TBST洗滌,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入相關(guān)抗體(均1∶1000稀釋),4 ℃孵育過夜,加入相關(guān)二抗(均1∶5000稀釋)室溫孵育,顯色后采用Image J分析條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織染色結(jié)果及Mankin評分比較 見表2(圖1)。染色結(jié)果顯示:與正常對照組比較,模型組關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙,細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次混亂,數(shù)量減少,潮線排列破壞嚴(yán)重;激動劑組軟骨組織病變程度更重;桃葉珊瑚苷+激動劑組小鼠關(guān)節(jié)軟骨表面稍光滑,細(xì)胞排列相對整齊,數(shù)量稍減少,潮線受損程度減輕;桃葉珊瑚苷組軟骨組織病變程度明顯改善。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示:與正常對照組比較,模型組Mankin評分升高(P<0.05);與模型組比較,桃葉珊瑚苷組Mankin評分降低(P<0.05);與桃葉珊瑚苷組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Mankin評分升高(P<0.05);與激動劑組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Mankin評分降低(P<0.05)。

表2 各組小鼠Mankin評分比較(分)

2.2 各組小鼠軟骨組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較 見表3。與正常對照組比較,模型組IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,桃葉珊瑚苷組IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(均P<0.05)。與桃葉珊瑚苷組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高(均P<0.05)。與激動劑組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(均P<0.05)。

表3 各組小鼠軟骨組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較(ng/L)

2.3 各組小鼠軟骨組織自噬相關(guān)基因、PI3K、AKT和mTOR mRNA水平比較 見表4。與正常對照組比較,模型組Atg5、Atg12、Baclin-1、LC3 mRNA降低,PI3K、AKT、mTOR mRNA水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,桃葉珊瑚苷組Atg5、Atg12、Baclin-1、LC3 mRNA升高,PI3K、AKT、mTOR mRNA降低(均P<0.05)。與桃葉珊瑚苷組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Atg5、Atg12、Baclin-1、LC3 mRNA降低,PI3K、AKT和mTOR mRNA升高(均P<0.05)。與激動劑組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Atg5、Atg12、Baclin-1、LC3 mRNA升高,PI3K、AKT和mTOR mRNA降低(均P<0.05)。

表4 各組小鼠軟骨組織自噬相關(guān)基因、PI3K、AKT和mTOR mRNA水平比較

2.4 各組小鼠軟骨組織自噬相關(guān)蛋白、LC3 Ⅱ/Ⅰ、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白水平比較 見表5。與正常對照組比較,模型組Atg5、Atg12、Baclin-1蛋白水平以及LC3 Ⅱ/Ⅰ降低,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,桃葉珊瑚苷組Atg5、Atg12、Baclin-1蛋白水平和LC3 Ⅱ/Ⅰ升高,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR 蛋白水平降低,而激動劑組與之相反(均P<0.05)。與桃葉珊瑚苷組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Atg5、Atg12、Baclin-1蛋白水平和LC3 Ⅱ/Ⅰ降低,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白水平升高(均P<0.05)。與激動劑組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Atg5、Atg12、Baclin-1和LC3 Ⅱ/Ⅰ升高,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白水平降低(均P<0.05)。

表5 各組小鼠軟骨組織自噬相關(guān)蛋白、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白水平比較

3 討 論

隨著病程進(jìn)展,骨關(guān)節(jié)炎患者常出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨退化,伴邊緣骨贅形成,好發(fā)于膝、髖、頸椎和腰椎等負(fù)重關(guān)節(jié),主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、肥大和活動受限。臨床上主要通過非甾體類抗炎藥、透明質(zhì)酸鈉、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑或聯(lián)合用藥等藥物治療,或采用針灸推拿、正骨治療等非藥物治療。但以上治療只能緩解骨關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀,延緩病情進(jìn)展,不能完全根治[11]。因此,尋找有效治療骨關(guān)節(jié)炎的新藥物具有重要的臨床意義。桃葉珊瑚苷具有廣泛的藥理學(xué)活性。研究[12]發(fā)現(xiàn),桃葉珊瑚苷通過抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗心肌缺血損傷的作用,從而改善急性心肌梗死小鼠心功能障礙。梅凡等[13]研究表明,桃葉珊瑚苷可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。但關(guān)于桃葉珊瑚苷能否通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬改善KOA的相關(guān)報(bào)道較少,因此本研究探討桃葉珊瑚苷對KOA小鼠的作用及機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示,KOA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙,細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次混亂、數(shù)量減少,潮線排列破壞嚴(yán)重。桃葉珊瑚苷組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病變程度明顯改善。模型組小鼠Mankin評分高于正常對照組,桃葉珊瑚苷組小鼠評分低于模型組。KOA患者常存在炎癥反應(yīng)損傷[14]。因此,本研究檢測了軟骨組織炎癥因子水平,結(jié)果顯示桃葉珊瑚苷可降低軟骨組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。以上結(jié)果表明桃葉珊瑚苷可保護(hù)KOA小鼠軟骨退變,降低膝關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。為進(jìn)一步明確桃葉珊瑚苷的作用機(jī)制,本研究采用PI3K/AKT/mTOR信號通路激動劑進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示桃葉珊瑚苷+激動劑組小鼠關(guān)節(jié)軟骨病理損傷程度較激動劑組減輕,炎癥因子水平較激動劑組降低,表明桃葉珊瑚苷可拮抗PI3K/AKT/mTOR信號通路激動劑對KOA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的損傷作用。自噬被認(rèn)為是影響KOA發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制[15]。研究[16]表明,自噬可能通過抑制軟骨細(xì)胞焦亡和改善軟骨下骨重塑來延緩小鼠KOA的病理進(jìn)展。Li等[17]研究表明,青蒿素通過激活細(xì)胞自噬水平減緩KOA小鼠進(jìn)程。本研究結(jié)果表明,桃葉珊瑚苷可誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因Atg5、Atg12、Baclin-1 mRNA和蛋白水平表達(dá),同時(shí)LC3 mRNA和LC3 Ⅱ/Ⅰ升高,表明桃葉珊瑚苷可以促進(jìn)KOA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬。

研究[18-19]發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT/mTOR信號通路參與細(xì)胞增殖、凋亡等過程,且與炎癥性疾病密切相關(guān)。激活PI3K/AKT/mTOR信號通路可抑制自噬過程[20]。本研究結(jié)果顯示,模型組PI3K/AKT/mTOR信號通路異常激活,桃葉珊瑚苷可抑制信號通路中各蛋白活化。而桃葉珊瑚苷+激動劑組信號通路活性低于激動劑組,表明桃葉珊瑚苷可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路異常激活。通過檢測自噬相關(guān)基因發(fā)現(xiàn),激動劑組Atg5、Atg12、Baclin-1和LC3 Ⅱ/Ⅰ較模型組降低,而與激動劑組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組以上指標(biāo)升高,表明激活PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制細(xì)胞自噬水平,而桃葉珊瑚苷可拮抗PI3K/AKT/mTOR信號通路激動劑對自噬的影響。

綜上所述,桃葉珊瑚苷可改善KOA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病變,減輕炎癥反應(yīng),其機(jī)制可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞自噬。