過表達叉頭盒F1對肝癌細胞增殖、周期和凋亡的影響及機制實驗研究

陳 萍,馬小平,蔡 爽,賈浴偵,李仕偉

(1.天水市第一人民醫院老年病科,甘肅 天水 741000;2.西安交通大學醫學部基礎醫學院細胞生物學與遺傳學系,陜西 西安 710061)

肝癌的發病率和病死率較高,其發生受到多種內外在因素的影響,包括肝硬化、年齡、性別、飲食習慣、遺傳因素等[1]。肝癌的發生涉及分子、細胞以及組織等多個層面的改變,包括細胞微環境改變、變異細胞免疫逃避增強等進而發展為癌組織。有研究[2]發現,約80%的癌細胞存在啟動子、調節基因、病毒插入、染色體變異和端粒酶改變等基因改變。

叉頭盒(Forkhead box,FOX)家族蛋白是DNA結合蛋白,具有調節、轉錄和修復DNA的功能,參與細胞生長、分化,且與胚胎發生有關[3]。近年來, FOX家族基因變異相關研究發現,其在癌癥發展中具有重要作用。其中,FOXA1過表達與肺癌、食管癌、乳腺癌、甲狀腺癌、宮頸癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤以及胰腺癌等有關;FOXO1基因在前列腺癌中缺失,在尤文氏肉瘤中表現為下調[4-7]。研究發現,乳腺癌中FOXF1啟動子高甲基化,結直腸癌中FOXF1異位表達,甲狀腺癌中FOXF1表達下降。因此,FOXF1與癌癥關系密切,但其與肝癌的關系相關研究較少,故本研究探討FOXF1對肝癌細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人源肝癌細胞系MHCC-97H細胞購自上海弘順生物科技有限公司,人源肝癌細胞系Huh7細胞購自大連美侖生物技術有限公司,培養環境為5% CO2、37 ℃。

1.2 主要試劑 甲基噻唑基四唑(MTT,批號:M0894)、RIPA裂解液(批號:CK53976)購自Sigma公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠二抗(批號:21C4824)購自KPL公司;鼠抗人FOXF1抗體(批號:21034678)、鼠抗人β-catenin抗體(批號:35R68924)、鼠抗人Wnt5a抗體(批號:21R85214)、抗GAPDH抗體(批號:2198384)購自Santa Cruz公司;Annexin V-FITC凋亡試劑(批號:FX672934)購自BD Bioscience公司;細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗體(批號:21098649)購自Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組:MHCC-97H細胞和Huh7細胞分別設立vector組(轉染空白載體)和ov-FOXF1組(轉染FOXF1過表達載體)。

1.3.2 FOXF1過表達載體構建及轉染:獲取擴增后目的基因microRNA(miRNA),插入空載體后轉入大腸桿菌培養,鑒定目的基因。將空白載體、FOXF1過表達載體提取后轉染,根據轉染試劑說明書將MHCC-97H細胞和Huh7細胞分別接種于96孔板中,培養過夜,然后加入載體及相關試劑,分別在24、48、72 h進行相關檢測。

1.3.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western bolt檢測轉染后FOXF1 mRNA及蛋白表達:轉染48 h后收集各組細胞,分別加入氯仿和異丙醇提取RNA。根據PCR擴增試劑說明書檢測FOXF1 mRNA表達量。FOXF1正向引物序列為5’-ATAAACTCAGATTGGAACACAG-3’,反向引物序列為5’-GTACTCTAAGCTTCCTGGCA-3’。采用RIPA裂解液提取細胞蛋白,進行電泳,轉膜,室溫封閉1 h后,分別加入鼠抗人FOXF1單克隆抗體(1∶1000稀釋)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1000稀釋),4 ℃孵育過夜,洗膜。加入HRP 標記的羊抗鼠二抗(1∶2000稀釋)室溫孵育2 h,洗膜。加入ECL化學發光底物,應用Syngene G∶Box系統拍照及分析。

1.3.4 MTT檢測肝癌細胞增殖:在轉染后的第1、2、3天,每天取5孔按MTT試劑說明書加入MTT試劑,繼續培養4 h,棄去上清,加入DMSO后上機檢測。

1.3.5 流式細胞術檢測肝癌細胞周期:轉染48 h后收集各組細胞,無水乙醇4 ℃固定過夜。根據試劑說明書加入核糖核酸酶A(RNaseA)、碘化丙啶(PI)染液等試劑后孵育。流式細胞儀檢測染色后細胞,記錄不同細胞周期所占比例。

1.3.6 流式細胞術檢測肝癌細胞凋亡:轉染48 h以后,收集各組細胞,制備成單細胞懸液,細胞濃度為15000個/ml。根據試劑說明書加入Annexin V-FITC和PI,孵育15 min。流式細胞儀檢測染色后的細胞,記錄凋亡細胞比例。

1.3.7 Western bolt檢測Wnt5a/β-catenin信號通路蛋白表達:轉染48 h后收集各組細胞,采用RIPA裂解液提取細胞蛋白,進行電泳、轉膜。室溫封閉1 h后,分別加入鼠抗人FOXF1單克隆抗體(1∶1000稀釋)、鼠抗人Wnt5a/β-catenin途徑相關蛋白單克隆抗體(1∶1000稀釋)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶3000稀釋)以及其他相關抗體,4 ℃孵育過夜,洗膜。用HRP 標記的羊抗鼠二抗(1∶2000稀釋)室溫孵育2 h,洗膜。加入ECL化學發光底物,應用Syngene G∶Box系統拍照及分析。

2 結 果

2.1 兩組Huh7細胞和MHCC-97H細胞FOXF1 mRNA及蛋白表達量比較 見圖1、2。RT-qPCR結果顯示,ov-FOXF1組Huh7細胞和MHCC-97H細胞FOXF1 mRNA表達量高于vector組(均P<0.05)。Western bolt結果顯示,ov-FOXF1組Huh7細胞和MHCC-97H細胞FOXF1蛋白表達高于vector組(均P<0.05)。

注:與vector組比較,*P<0.05

圖2 兩組Huh7(左)和MHCC-97H(右)細胞FOXF1蛋白電泳圖

2.2 過表達FOXF1對肝癌細胞增殖的影響 見圖3。MTT結果顯示,轉染后24 h兩組Huh7和MHCC-97H細胞增殖情況比較差異無統計學意義(均P>0.05);轉染后48、72 h,ov-FOXF1組Huh7和MHCC-97H細胞增殖受到抑制(均P<0.05)。

注:與vector組比較,*P<0.05

2.3 過表達FOXF1對肝癌細胞周期的影響 見圖4。流式細胞儀檢測結果顯示,與vector組比較,ov-FOXF1組Huh7細胞和MHCC-97H細胞G1/G0期細胞比例升高,S期細胞比例降低(均P<0.05);ov-FOXF1組G2/M期Huh7細胞比例較vector組降低(P<0.05);MHCC-97H細胞兩組G2/M期細胞比例比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

注:與vector組比較,*P<0.05

2.4 過表達FOXF1對肝癌細胞凋亡的影響 見圖5。流式細胞儀檢測結果顯示,ov-FOXF1組Huh7細胞和MHCC-97H細胞凋亡比例高于vector組(均P<0.05)。

注:與vector組比較,*P<0.05

2.5 過表達FOXF1對Wnt5a/β-catenin信號通路蛋白表達的影響 見圖6。Western blot結果顯示,與vector組比較,ov-FOXF1組FOXF1、active Caspase-3蛋白表達增加,Wnt5a、β-catenin、c-myc、Cyclin D1蛋白表達降低(均P<0.05)。

圖6 兩組Huh7(左)和MHCC-97H(右)細胞Wnt5a/β-catenin信號通路蛋白電泳圖

3 討 論

FOXF1作為轉錄調節因子,能夠調控多種基因的表達,其位于基因表達體系的上游,若發生功能異常可能會導致下游基因表達網絡異常,進而導致細胞增殖、分化錯誤甚至癌變,但關于FOXF1上游的調控機制仍需進一步探索。

本研究發現FOXF1過表達時,Huh7和MHCC-97H細胞增殖能力降低,細胞周期進展阻滯,凋亡細胞比例增加,表明FOXF1過表達能抑制肝癌細胞。根據細胞周期控制的經典模型,D型細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶4 (CDK4)或CDK6調節早期G1期,而CDK觸發合成S期。此外,Cyclin A與CDK1及CDK2復合物調節DNA合成期的完成,Cyclin B和CDK1復合物作用于有絲分裂[8-10]。研究[11]發現,高表達FOXF1可能通過增強p21來抑制Cyclin A2、B1、D1、E2,使細胞無法進入DNA合成期。本研究Western blot結果顯示,過表達FOXF1使Cyclin D1蛋白表達降低,表明FOXF1可通過上述途徑抑制肝癌細胞周期的進展,進而抑制細胞增殖。Caspase家族是與秀麗隱桿線蟲細胞死亡異常3基因高度同源的蛋白質家族。Caspase家族可分為起始Caspase(2、8、9、10)、劊子手Caspase(3、6、7)和炎性Caspase(1、4、5、11)。其中,Caspase-3可以被內源性和外源性凋亡途徑激活,在細胞凋亡中處于關鍵位置[12-13]。Caspase-3以無活性的酶原游離于胞漿中,在D175位點被顆粒酶B或Caspase-10切割時部分活化。Caspase-3的激活導致質膜脫落、染色質凝聚、DNA裂解和磷脂酰絲氨酸暴露在質膜的外側。在腫瘤治療中,許多化學治療劑通過誘導細胞凋亡對腫瘤細胞發揮細胞毒作用。過表達FOXF1能夠激活凋亡相關途徑,上調Caspase-3表達,使腫瘤細胞進入凋亡階段,進而發揮抑癌作用[14-15]。c-myc基因表達涉及多個細胞過程,如細胞增殖、分化、代謝和凋亡等,其過表達可能導致多種癌癥,如粒細胞白血病、乳腺癌、肺癌等。研究[16]顯示,過表達FOXF1可以有效降低c-myc基因表達量,進而發揮抑癌作用。

本研究發現,過表達FOXF1降低Wnt5a、β-catenin蛋白表達。Wnt/β-catenin途徑與肝癌的發生有關。該途徑是人體的保守信號傳導途徑,具有調節細胞增殖、分化、遷移等功能,甚至能夠維持遺傳的穩定性。Wnt/β-catenin途徑改變會導致其調控的一系列基因表達異常,進而影響細胞的增殖、分化速度與方向,甚至發展為癌細胞[17-19]。Wnt5a作為配體與FZD蛋白結合,抑制細胞內β-catenin破壞復合物的功能,進而導致β-catenin累積。β-catenin在細胞核內作為轉錄調節因子發揮作用,在細胞內累積會導致細胞增殖、分化相關的基因表達異常,進而發生癌變[20-21]。多項研究表明,Wnt/β-catenin途徑與結腸癌、肝癌、卵巢癌以及黑色素瘤等癌癥密切相關,而且與癌癥的轉移有關。

綜上所述,FOXF1過表達能夠抑制肝癌細胞的增殖及周期進展,促進細胞凋亡,其機制可能與調控Wnt5a/β-catenin通路及細胞周期相關蛋白等有關。