長鏈非編碼RNA YAF2-AS1通過調控微小RNA-141-3p表達抑制肝星狀細胞活化實驗研究

劉 俊,曾 龍,高 云,敖會芳,林 勇,魏雪源

(1.荊門市人民醫院 荊楚理工學院附屬中心醫院感染性疾病科,湖北 荊門 448000;2.荊門市人民醫院 荊楚理工學院附屬中心醫院血液內科,湖北 荊門 448000;3.上海長征醫院消化內科,上海 200003)

肝纖維化是以肝組織結構改變以及肝功能損傷為特征的一類疾病,其發生率在近幾十年中快速增長[1]。肝纖維化的發生與病毒感染、肥胖、藥物、糖尿病以及酗酒等因素相關,是肝硬化和肝癌發生的重要原因[2]。大量研究[3-4]證實,肝纖維化發生的關鍵環節是肝星狀細胞活化。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是內源性長鏈RNA,屬于單鏈RNA家族,通過轉錄水平修飾調控基因的表達,參與各種疾病的發生和發展[5-6]。研究[7-8]報道,lncRNA與肝星狀細胞的活化和凋亡有關,是肝纖維化診斷、分型、治療和預后監測的靶點。YAF2-AS1是由396個核苷酸組成的lncRNA,其編碼基因位于人染色體12q12區域,含有3個外顯子。目前關于YAF2-AS1在肝纖維化中的作用和機制鮮有報道。本研究探討YAF2-AS1在肝纖維化組織中的表達水平,觀察YAF2-AS1對肝星狀細胞活化的作用及機制,為YAF2-AS1/micro-RNA-141-3p(miR-141-3p)在肝纖維化診療和預后評估中的應用提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要試劑 人肝星狀細胞株LX-2購自中科院上海細胞庫。DMEM培養基和胎牛血清(批號:12491015、A4766801)購自美國Thermo Fisher公司;CCK-8實驗試劑盒、細胞周期試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒(批號:C0039、C1052、S0033M)購自上海碧云天生物有限公司;miR-141-3p、mimic NC、YAF2-AS1質粒以及陰性對照質粒(批號:L4535、L3050、H189、H238)購自上海集奇生物科技有限公司;Lipofectamine 3000、實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒(批號:L3000008、12361010)購自美國Invitrogen公司;熒光素酶野生型質粒pMIR-YAF2-AS1 WT、突變型質粒pMIR-YAF2-AS1 MUT(批號:GF22111-5191、GF22111-5192)購自上海歌凡生物科技有限公司;雙熒光素酶活性試劑盒(批號:150327)購自美國Millipore公司;兔抗人磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)、兔抗人磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、兔抗人α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、兔抗人Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)、兔抗人轉化生長因子β受體Ⅱ(TGFβR2)、兔抗人β微管蛋白(β-Tubulin)抗體(批號:ab267787、ab8805、ab5831、ab138492、ab184948、ab18207)購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學分析:采用基因表達數據庫(GEO)分析YAF2-AS1在肝纖維化組織和正常肝組織中的表達。使用lncRMap軟件預測YAF2-AS1的靶向基因。

1.2.2 細胞培養與質粒轉染:配制含12%胎牛血清的DMEM培養基,在37 ℃、5% CO2環境中培養LX-2細胞。轉染前16 h,取對數生長期的LX-2細胞接種于12孔板,每孔2 ml。通過Lipofectamine 3000試劑將陰性對照質粒(對照組)和YAF2-AS1質粒(YAF2-AS1組)轉染至LX-2細胞,轉染濃度為70 nmol/L,轉染7 h后更換培養基。

1.2.3 qRT-PCR檢測YAF2-AS1和miR-141-3p表達:提取各組LX-2細胞總RNA,通過核酸檢測儀分析RNA濃度,反轉錄合成cDNA。設置qRT-PCR參數:96 ℃ 6 min;96 ℃ 16 s,56 ℃ 26 s,64 ℃ 26 s,共39個循環。采集各循環的熒光信號,分析熔解曲線。以U6和GAPDH為內參,引物序列見表1。以2-ΔΔCt法分析YAF2-AS1和miR-141-3p表達。

表1 各基因引物序列

1.2.4 CCK-8法檢測LX-2細胞增殖:收集各組LX-2細胞,以1500個/孔接種于96孔板,在37 ℃、5% CO2環境中分別培養1、2、3、4、5 d。配制體積分數為10%的CCK-8試劑,在每天恒定時間點于每孔加入25 μl CCK-8試劑,在37 ℃、5% CO2環境中培養3 h,通過酶標儀分析各孔LX-2細胞在波長450 nm處的光密度值。

1.2.5 流式細胞術檢測LX-2細胞周期:采用胰蛋白酶(不含EDTA)消化收集各組LX-2細胞,用3 ml 80%乙醇固定。12 h后,離心棄上清。磷酸緩沖鹽溶液清洗2次,加入RNA酶重懸,在37 ℃環境培養40 min。110 μl碘化丙啶溶液染色20 min。篩網過濾到流式細胞管,流式細胞儀檢測各組LX-2細胞周期。

1.2.6 流式細胞術檢測LX-2細胞ROS水平:采用無血清培養基稀釋二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA),稀釋比例為800∶1。收集各組LX-2細胞,重懸于DCFH-DA溶液中,在37 ℃、5% CO2環境中培養20 min,每隔4 min顛倒混勻,保證探針與LX-2細胞充分接觸。使用不含血清的培養基清洗LX-2細胞4次,過濾到流式細胞管,流式細胞儀檢測ROS水平。

1.2.7 雙熒光素酶活性實驗檢測YAF2-AS1和miR-141-3p的靶向結合:將對數生長期的LX-2細胞接種于24孔板,設置mimi NC/pMIR-YAF2-AS1 WT組、miR-141-3p/pMIR-YAF2-AS1 WT組、mimi NC/pMIR-YAF2-AS1 MUT組、miR-141-3p/pMIR-YAF2-AS1 MUT組,通過Lipofectamine 3000將質粒和miRNA轉染至LX-2細胞。在37 ℃、5% CO2環境中培養30 h,根據雙熒光素酶活性試劑盒分析各組LX-2細胞的熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot檢測PTEN/AKT信號通路蛋白和肝纖維化標志物表達:各組LX-2細胞中加入RIPA裂解液,超聲裂解7次,冰上孵育15 min,高速離心取上清,與上樣緩沖液搖床混勻,煮沸9 min。用8% SDS-PAGE膠分離各組LX-2細胞總蛋白,轉膜蛋白到聚偏二氯乙烯膜。用6%(質量分數)牛血清白蛋白溶液室溫封閉50 min。加入兔抗人PTEN(1∶2000稀釋)、兔抗人p-AKT(1∶1000稀釋)、兔抗人α-SMA(1∶3000稀釋)、兔抗人Collagen I(1∶2000稀釋)、兔抗人TGFβR2(1∶3000稀釋)、兔抗人β-Tubulin(1∶3000稀釋,內參),孵育15 h。洗膜后,加入羊抗兔二抗(1∶6000稀釋)孵育3 h。洗膜后,在化學發光成像儀中曝光和成像。

2 結 果

2.1 生物信息學分析結果 GEO數據庫顯示,與正常肝組織比較,肝纖維化組織中YAF2-AS1表達水平降低(P<0.01)。

2.2 兩組LX-2細胞YAF2-AS1表達量比較 qRT-PCR結果顯示,YAF2-AS1組LX-2細胞YAF2-AS1表達量高于對照組(9.98±1.45與1.02±0.40,P<0.01)。

2.3 過表達YAF2-AS1對LX-2細胞增殖的影響 見圖1。CCK-8實驗結果顯示,與對照組比較,YAF2-AS1組LX-2細胞從第2 天開始增殖受到抑制(均P<0.05)。

注:與對照組比較,*P<0.05,#P<0.01

2.4 過表達YAF2-AS1對LX-2細胞周期的影響 見圖2。流式細胞儀檢測結果顯示,與對照組比較,YAF2-AS1組在G0/G1期細胞比例升高,S期和G2/M期細胞比例降低(均P<0.05)。

注:與對照組比較,*P<0.05,#P<0.01

2.5 過表達YAF2-AS1對LX-2細胞ROS含量的影響 見圖3。流式細胞儀檢測結果顯示,與對照組比較,YAF2-AS1組LX-2細胞ROS含量升高(P<0.01)。

注:與對照組比較,#P<0.01

2.6 YAF2-AS1對miR-141-3p的靶向調控作用 見圖4、5。lncRMap軟件分析結果顯示,YAF2-AS1與miR-141-3p存在結合位點,YAF2-AS1和miR-141-3p可能靶向結合。雙熒光素酶活性實驗顯示,與mimic NC比較,miR-141-3p共轉染pMIR-YAF2-AS1 WT質粒后的熒光素酶活性降低(P<0.01),miR-141-3p共轉染pMIR-YAF2-AS1 MUT質粒后的熒光素酶活性無明顯改變(P>0.05)。

圖4 YAF2-AS1與miR-141-3p結合位點

注:與mimic NC比較,#P<0.01

2.7 過表達YAF2-AS1對miR-141-3p表達的影響 qRT-PCR結果顯示,YAF2-AS1組miR-141-3p表達水平低于對照組(0.99±0.36與6.38±0.52,P<0.01)。

2.8 過表達YAF2-AS1對PTEN/AKT信號通路蛋白和肝纖維化標志物表達的影響 見圖6。Western blot實驗結果顯示,與對照組比較,過表達YAF2-AS1后PTEN蛋白表達升高,p-AKT蛋白及肝纖維化標志物α-SMA、Collagen Ⅰ和TGFβR2表達降低(均P<0.05)。

圖6 PTEN/AKT信號通路蛋白和肝纖維化標志物蛋白電泳圖

3 討 論

肝星狀細胞在各種慢性肝損傷的刺激下活化并分泌膠原,促進肝組織纖維化[9]。有效阻斷肝星狀細胞的活化,減少膠原的分泌和沉積,可能是抑制肝組織發生纖維化的重要途徑[10]。lncRNA在非酒精性脂肪性肝病、肝癌、急慢性肝炎等肝臟疾病的病理過程中發揮重要作用[11-13]。越來越多的研究[14-16]證實,lncRNA可能與肝星狀細胞的活化密切相關。例如,肝臟組織lncRNA H19表達水平與肝纖維化的嚴重程度密切相關,沉默lncRNA H19能夠有效抑制肝星狀細胞的活性,減少成纖維細胞的增殖和基質形成,預防肝纖維化[17]。lncRNA SNHG7在肝纖維化組織和肝星狀細胞中明顯升高,靶向抑制lncRNA SNHG7可以減輕動物模型的肝纖維化,miR-29b是lncRNA SNHG7的靶基因[18]。目前,YAF2-AS1在肝纖維化發生中的作用并不清楚。

本研究顯示,肝纖維化組織中YAF2-AS1的表達水平明顯低于正常肝組織,說明YAF2-AS1可能參與調控肝纖維化。進一步研究發現,轉染YAF2-AS1質粒后肝星狀細胞LX-2的增殖能力明顯降低,LX-2細胞周期被抑制在G0/G1期,同時LX-2細胞內的ROS水平升高,提示YAF2-AS1能夠顯著抑制肝星狀細胞LX-2的活化。且YAF2-AS1質粒轉染LX-2細胞后,肝纖維化標志物α-SMA、Collagen Ⅰ、TGFβR2表達均降低,表明YAF2-AS1對肝纖維化有抑制作用。后基因組學研究[19-21]顯示,lncRNA充當競爭性內源RNA,靶向結合miRNA的反應元件,調控細胞的病理生理過程。本研究采用生物信息學軟件lncRMap分析YAF2-AS1的靶向基因,結果表明miR-141-3p與YAF2-AS1存在互補的結合位點。雙熒光素酶活性實驗證實YAF2-AS1可結合miR-141-3p。

近年來,miR-141-3p被證實在多種腫瘤如視網膜母細胞瘤、腎透明細胞癌以及鼻咽癌中異常表達,是診斷腫瘤的分子標志物,且miR-141-3p在調控腫瘤細胞侵襲、代謝、增殖和遷移等活動中發揮重要調控作用[22-24]。研究[25]發現,miR-141-3p能夠有效促進肝星狀細胞的增殖能力,誘導細胞周期的進展,降低細胞的凋亡水平,同時升高細胞的促纖維化蛋白,顯著促進肝星狀細胞的活化。本研究發現,轉染YAF2-AS1質粒后肝星狀細胞LX-2中miR-141-3p表達下調,證實YAF2-AS1能夠抑制miR-141-3p表達。有研究[25]顯示,miR-141-3p主要通過PTEN/AKT信號通路在肝纖維化的過程中發揮促進作用。為進一步證實YAF2-AS1對miR-141-3p表達的抑制作用,本研究觀察了YAF2-AS1對PTEN/AKT信號通路的調控功能,結果顯示YAF2-AS1質粒轉染的LX-2細胞中PTEN蛋白表達升高,p-AKT蛋白表達降低。

綜上所述,YAF2-AS1在肝纖維化組織中表達降低,其通過下調miR-141-3p表達抑制肝星狀細胞的活化。YAF2-AS1調控miR-141-3p通路表達可能為肝纖維化診斷、預后評估和治療提供新標志物和靶點。