miR-448/RTN4軸調(diào)控結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶耐藥性的機制研究

裴正浩 王耿澤 景小松

結(jié)直腸癌(CRC)是全球第三大致命癌癥,由于其侵襲性行為、預后不良和缺乏靶向治療而顯示出較高的發(fā)病率[1]。CRC患者的總體相對5年生存率約為50%[2]。幾乎一半的 CRC 患者在診斷時或病程后期都面臨肝轉(zhuǎn)移[3]。基于5-Fu的化療在CRC的治療中起著重要作用。然而,長期成功施用5-Fu引起的多藥耐藥嚴重削弱了治療效果。許多機制,如基因突變、DNA甲基化和組蛋白修飾,都與癌細胞對化療藥物的耐藥性有關[4-7]。最近,人們在分析 miRNA 在多種癌癥耐藥性發(fā)展中的作用方面做出了許多努力,結(jié)果表明,化學耐藥癌細胞及其親代化學敏感細胞具有不同的 miRNA 表達模式,參與了腫瘤細胞的耐藥過程。此外,研究表明,恢復失調(diào)的 miRNA 可以有效地克服耐藥性[8-14]。但是,CRC中miRNA與靶向基因?qū)?-Fu 耐藥性的分子機制尚不明確。基于此,本研究將以結(jié)直腸癌細胞系HCT116和HT29為研究對象,旨在探討結(jié)腸癌細胞對5-Fu的耐藥性及潛其在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

包括HCT116和HT29在內(nèi)的結(jié)腸癌細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。miR-488 inhibitor、miR-206 mimics和miRNA模擬物的適當陰性對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司。RTN4 siRNA和對照siRNA購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。MTS檢測試劑盒購自美國Promega公司。TRIzol RNA Kit購自美國invitrogen公司。SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國invitrogen公司。SsoFasrTM Probes Supermix購自美國Bio-rad公司。RTN4和GAPDH的抗體購自美國abcam公司。膜聯(lián)蛋白-Alexa 488和PI購自美國abcam公司。即用型免疫組化試劑盒(兔鼠通用)常規(guī)型購自湖北百奧斯生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 細胞在含有 10% 胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),并將其置于在37 ℃和5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。5-Fu 抗性細胞系HCT116/FR和HT29/FR是通過逐步增加的5-Fu濃度孵育而形成。為了研究結(jié)直腸癌細胞中5-Fu抗性的機制,本研究篩選出HCT116和HT29 5-Fu抗性細胞系(HCT116/FR和HT29/FR細胞)。5-Fu抗性細胞篩選具體操作如下:HCT116和HT29細胞用5-Fu的劑量從10 μg/mL的濃度開始,以10 μg/mL的濃度為增量,增加到120 μg/mL的濃度為止,每個濃度處理結(jié)腸癌細胞1個月。處理過程中,每輪后,當存活細胞達到>70%匯合時,進行胰酶消化傳代,并增加5-Fu的劑量。根據(jù)制造商的說明,將HCT116細胞接種在12孔板中24 h以達到30%～40%的匯合度,并使用RTN4 siRNA或?qū)φ誷iRNA siGFP使用Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染細胞。

1.2.2 RNA抽取與實時定量PCR 根據(jù)制造商的方案,使用TRIzol RNA Kit提取總RNA。總RNA用于使用SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶生成cDNA。聚合酶鏈反應(PCR)使用SsoFasrTM Probes Supermix以 20 μL 的最終反應體積進行3次重復,使用基因特異性引物/探針組和標準熱循環(huán)程序(35個循環(huán))在 Bio-Rad CFX96TM實時PCR系統(tǒng)上。使用TaqMan基因表達實時PCR測定法評估相對基因mRNA水平。結(jié)果表示為閾值循環(huán)(Ct)。根據(jù)制造商的協(xié)議,通過比較Ct方法(ΔΔCt) 確定目標轉(zhuǎn)錄物的相對定量。 2-ΔΔCt法用于分析基因表達的相對變化。在沒有逆轉(zhuǎn)錄的情況下進行對照實驗以確認總RNA沒有被基因組DNA污染。GAPDH表達作為RTN4的內(nèi)參。U6 RNA作為miRNA的內(nèi)部對照。

1.2.3 免疫印跡 使用針對 RTN4和GAPDH的抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析。

1.2.4 細胞增殖水平的檢測 24 h后,細胞以4×103個細胞/孔的密度在96孔板中培養(yǎng)。 然后用濃度增加的5-Fu處理細胞 72 h。隨后,根據(jù)制造商的說明,使用MTS 檢測試劑盒進行細胞增殖水平的檢測。使用 Wallac Victor 1420 Multilabel Counter測量發(fā)光。每個測定一式3份進行并重復3次。

1.2.5 熒光素酶報告實驗 為了評估m(xù)iR-448的功能,將RTN4的3'-UTR擴增并插入熒光素酶報告基因 載體pMIR-REPORT 中。。使用RTN4-WT-3'-UTR作為模板擴增RTN4-WT-3'-UTR,并使用定點誘變試劑盒構(gòu)建突變質(zhì)粒。對于熒光素酶報告基因檢測,將細胞與miR-448 mimics和WT或RTN4-MT-3'-UTR以及作為內(nèi)部對照的海腎熒光素酶pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后,收集細胞并使用RIPA緩沖液裂解。然后根據(jù)制造商的說明使用雙熒光素酶測定系統(tǒng)測量熒光素酶活性。

1.2.6 細胞凋亡的檢測 使用膜聯(lián)蛋白-Alexa 488和PI進行膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶染色,顯微鏡觀察凋亡情況。

1.2.7 免疫組織化學 納入治療的結(jié)腸癌患者26例,其中男性16例,女性10例,平均年齡(56.14±16.15)歲。收集患者的實體腫瘤標本,按照化療效果分為對化療敏感型結(jié)腸癌患者(Sensitive)與化療抵抗型結(jié)腸癌患者(Resistant)。所有患者均知情同意并且簽署知情同意書。本研究由我院的倫理委員會批準:倫理批號“201902-041”。

應用即用型免疫組化試劑盒對兩類患者的腫瘤樣本進行RTN4的免疫組織化學分析,根據(jù)染色程度從淺到深分成4個等級:0級、1級、2級和3級,其中0級和1級定義為RTN4低表達、2級和3級定義為RTN4低表達,本研究所有展示的圖為典型圖。

1.2.8 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均表示為至少一式三份樣品的平均值±標準偏差。統(tǒng)計分析包括使用 Graph-Pad Prism V 軟件的單向方差分析或?qū)W生t檢驗。卡方檢驗分析RTN4表達高低與結(jié)直腸癌患者化療敏感的相關性。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 5-Fu抗性的HT29和HCT116細胞的構(gòu)建

5-Fu處理可以顯著抑制親本細胞的增殖和誘導細胞凋亡(P<0.05),但不能抑制抗性細胞,見圖1A、圖1B和圖1C。此外,在5-Fu處理后,HCT116/FR和HT29/FR中細胞周期階段的分布發(fā)生了顯著變化。5-Fu處理可在HCT116和HT29細胞中顯著誘導G1期停滯(P<0.05),但在HCT116/FR和RKO/FR中則不然,見圖1D和圖1E。這些數(shù)據(jù)表明,5-Fu抗性細胞(HCT116/FR 和 HT29/FR)已成功篩選出。

圖1 5-Fu抗性的HT29和HCT116細胞的構(gòu)建

2.2 RTN4對5-Fu抗性的HT29和HCT116細胞的影響

將5-Fu處理和未處理的HCT116/FR細胞進行高通量測序,發(fā)現(xiàn)5-Fu處理后,多個基因的表達水平被調(diào)節(jié),見圖2A。通過siRNA篩選,發(fā)現(xiàn)當敲低RTN4時,HCT116/FR細胞的凋亡水平下降(P<0.05),見圖2B。使用5-Fu處理HCT116/FR細胞和HT29/FR細胞后,發(fā)現(xiàn)RTN4的mRNA水平均下調(diào)(P<0.05),見圖2C和圖2D。但是,RTN4的轉(zhuǎn)錄水平并沒有變化(P>0.05),見圖2E和圖2F。在HCT116和HT29細胞中敲低RTN4后并用5-Fu處理,發(fā)現(xiàn)HCT116和HT29顯示出對5-Fu抑制增殖的抵抗(P<0.05),見圖2G和圖2H。過表達RTN4后,發(fā)現(xiàn)HCT116/FR和HT29/FR細胞的凋亡水平上升(P<0.05),見圖2I和圖2J。敲低RTN4后,發(fā)現(xiàn)HCT116/FR和HT29/FR細胞的凋亡水平下降(P<0.05),見圖2K和圖2L。

圖2 RTN4對5-Fu抗性的HT29和HCT116細胞的影響

2.3 miR-448靶向RTN4促進HT29和HCT116細胞對5-Fu的抵抗

通過miRDB在線分析發(fā)現(xiàn),有多個miRNA靶向RTN4。5-Fu處理后,發(fā)現(xiàn)HT29/FR細胞中miR-448的表達水平上升(P<0.05),見圖3A。5-Fu處理后,發(fā)現(xiàn)HCT116/FR細胞中miR-448的表達水平上升(P<0.05),見圖3B。5-Fu處理后并過表達miR-448后,HCT116的凋亡水平下降(P<0.05);5-Fu處理后并敲低miR-448后,HCT116的凋亡水平上升(P<0.05),見圖3C。5-Fu處理后并過表達miR-448后,HT29的凋亡水平下降(P<0.05);5-Fu處理后并敲低miR-448后,HT29的凋亡水平上升(P<0.05),見圖3D。在HCT116/FR細胞中,過表達miR-448后,RTN4的表達水平下降;敲低miR-448后,RTN4的表達水平上升(P<0.05),見圖3E。在HT29/FR細胞中,過表達miR-448后,RTN4的表達水平下降;敲低miR-448后,RTN4的表達水平上升(P<0.05),見圖3F、圖3H和圖3I。同時,miR-448靶向RTN4的3端非編碼區(qū),見圖3G。此外,通過免疫組織化學分析發(fā)現(xiàn)對化療敏感的結(jié)腸癌患者癌組織中RTN4表達水平較高(P<0.05),見圖3J。

圖3 miR-448靶向RTN4促進HT29和HCT116細胞對5-Fu的抵抗

3 討論

結(jié)直腸癌是結(jié)直腸上皮細胞的癌癥,已被確定為全球第三大最常見的癌癥類型[15-19]。它是由多種因素共同引起的,包括飲食、基因突變以及生殖或外源激素的使用[20-22]。為防止病情進一步惡化,目前不同階段的結(jié)直腸癌治療藥物主要是5-Fu等常規(guī)化療藥物;然而,結(jié)直腸癌易對5-Fu產(chǎn)生耐藥性[22]。

在本研究中,敲低RTN4時,HCT116/FR細胞的凋亡水平下降(P<0.05)。使用5-Fu處理HCT116/FR細胞和HT29/FR細胞后,RTN4的mRNA水平均下調(diào)(P<0.05)。但是,RTN4的轉(zhuǎn)錄水平并沒有變化(P>0.05)。在HCT116和HT29細胞中敲低RTN4后并用5-Fu處理,HCT116和HT29顯示出對5-Fu抑制增殖的抵抗(P<0.05)。過表達RTN4后,HCT116/FR和HT29/FR細胞的凋亡水平上升(P<0.05)。敲低RTN4后,HCT116/FR和HT29/FR細胞的凋亡水平下降(P<0.05)。5-Fu代謝的基本酶是胸苷酸合成酶,它屬于5-Fu合成代謝3個途徑中最重要的一個。像其他參與5-Fu合成或分解代謝的酶一樣,它們經(jīng)常被改變,促進5-Fu抗性。此外,5-Fu還可改變CRC細胞的主要細胞功能(凋亡、自噬、呼吸、糖代謝和細胞周期),這些細胞功能的改變構(gòu)成了關鍵的5-Fu抗性機制[23]。網(wǎng)狀蛋白(RTN)已被鑒定為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整合膜蛋白,涉及多種凋亡信號通路。該家族包括四個旁系同源物,稱為RTN1、RTN2、RTN3 和 RTN4[24]。先前的研究表明[25],RTN3的過表達可能會通過Bcl-2的異位過表達來誘導正常HeLa細胞的細胞凋亡。RTN4在HEK293人胚胎腎細胞系中高度表達,并觀察到其可通過c-Jun N端激酶-c-Jun信號通路誘導細胞凋亡[26]。此外,RTN4通過誘導細胞凋亡抑制肝細胞癌細胞的生長[27]。因此,RTN4是促進腫瘤細胞凋亡的關鍵分子,并且RTN4通過參與細胞凋亡來影響腫瘤細胞對5-Fu的抵抗。

本研究中,使用5-Fu處理HCT116/FR細胞和HT29/FR細胞后,發(fā)現(xiàn)RTN4的mRNA水平均下調(diào)(P<0.05)。但是,RTN4的轉(zhuǎn)錄水平并沒有變化(P>0.05)。提示RTN4在轉(zhuǎn)錄后水平受到調(diào)控。miRNA是內(nèi)源性21～24個核苷酸的單鏈非編碼RNA,通過不完全互補匹配與3'-UTR的目標mRNA結(jié)合,從而通過翻譯抑制或mRNA切割來降低蛋白質(zhì)表達[28]。先前的報告表明,miRNA參與各種生物過程,如組織穩(wěn)態(tài)、器官發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡和人類疾病[29]。在癌細胞中,miRNA可能通過靶向腫瘤抑制基因的方式作為腫瘤啟動子發(fā)揮作用[30]。5-Fu處理后,HT29/FR細胞中miR-448的表達水平上升(P<0.05)。5-Fu處理后,HCT116/FR細胞中miR-448的表達水平上升(P<0.05)。5-Fu處理后并過表達miR-448后,HCT116的凋亡水平下降(P<0.05);5-Fu處理后并敲低miR-448后,HCT116的凋亡水平上升(P<0.05)。5-Fu處理后并過表達miR-448后,HT29的凋亡水平下降(P<0.05);5-Fu處理后并敲低miR-448后,HT29的凋亡水平上升(P<0.05)。在HCT116/FR細胞中,過表達miR-448后,RTN4的表達水平下降;敲低miR-448后,RTN4的表達水平上升(P<0.05)。在HT29/FR細胞中,過表達miR-448后,RTN4的表達水平下降;敲低miR-448后,RTN4的表達水平上升(P<0.05)。同時,miR-448靶向RTN4的3端非編碼區(qū)。

綜上所述,當結(jié)腸癌細胞HCT116和HT29遇到5-Fu后,細胞中miR-448的表達水平上升,miR-448靶向RTN4 mRNA的3端非編碼區(qū)并降解了RTN4 mRNA,減少了RTN4的蛋白表達,最終提升了結(jié)腸癌細胞HCT116和HT29對5-Fu的抗性。