TLR4和腸道菌群在原發性肝癌進展中動態變化及與其預后的關系

李 慧 康純嘉 董賽男 張心敏

原發性肝癌致病原因復雜多樣,隨著病情進展,可對患者生命安全構成威脅[1]。相關研究表明,原發性肝癌與乙型肝炎病毒(HBV)感染及其誘發的相關炎癥反應等存在密切聯系,肝病患者存在小腸細菌過度生長情況[2-3]。因肝病患者多伴有肝功能障礙,機體內腸黏膜通透性增加、白蛋白及酶類生成量減少、肝臟對內毒素清除能力的減弱,使得腸腔內大量的外來致病菌長時間的停滯,結腸菌群不斷上移,小腸腔內毒素聚集后增多,致使受損腸黏膜釋放入血后形成腸源性內毒素血癥[4-5]。Toll-樣受體4(TLR4)屬TLR家族,為Ⅰ型跨膜蛋白受體,可識別病原微生物分值的病原相關分子模式(PAMPs),相互作用可啟動TLR4信號轉導途徑后發揮其效應。TLR4還可通過特異性識別PAMPs并與其相結合后啟動TLR4信號傳導途徑,最終誘發免疫炎癥反應,導致肝癌患者病情進展[6-7]。目前,臨床關于腸道菌群與TLR4在原發性肝癌進展中的研究較少。對此,本研究回顧性分析2019年2月至2021年6月于我院就診的肝臟疾病患者120例的臨床資料,分析TLR4和腸道菌群在原發性肝癌進展中動態變化,旨在探究其與預后的關系,旨在為原發性肝癌的預防及治療提供新思路。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年2月至2021年6月于我院就診的肝臟疾病患者120例的臨床資料,其中40例肝硬化合并乙型肝炎患者納入肝硬化組,50例慢性乙型肝炎患者納入肝炎組,30例肝癌患者納入肝癌組。肝硬化組男性27例,女性13例;年齡34～68歲,平均年齡(50.86±5.91)歲;體質量指數為20.6～26.8 kg/m2,平均體質量指數為(23.71±1.13)kg/m2。肝炎組男性33例,女性17例;年齡34～69歲,平均年齡(50.79±5.88)歲;體質量指數為20.8～26.7 kg/m2,平均體質量指數為(23.66±1.08)kg/m2。肝癌組男性20例,女性10例;年齡35～70歲,平均年齡(51.02±6.01)歲;體質量指數為20.5～26.8 kg/m2,平均體質量指數為(23.72±1.20)kg/m2。對照組為我院同期行健康體檢的100例志愿者,其中男性62例,女性38例;年齡34～69歲,平均年齡(50.82±5.95)歲;體質量指數為20.6～27.0 kg/m2,平均體質量指數為(23.80±1.09)kg/m2。四組一般資料對比,差異無統計學意義(P>0.05)。具有可比性。

1.2 入選標準

納入標準:肝癌患者TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期,均行根治性手術;患者及家屬均知情同意本次研究。排除標準:伴有胃腸道疾病;合并其他類型肝炎;參與本研究前30 d已接受其他相關治療;病歷資料缺乏;無法完成本次研究者。

1.3 方法

(1)所有參檢者于入組后第1 d采集3 ml清晨空腹肘靜脈血,將血液標本放置于抗凝試管中,充分混勻,應用流式細胞技術測定TLR4表達水平。將血液標本放置于兩個各含100 L的抗凝血液標本,1支分別加入5 L FITC-CD14單抗及5 LPE-TLR4單抗,另1支試管中加入5 L PBS液,將其充分搖勻后置于4 ℃環境下放置30 min,隨后于兩支試管中加入2 ml紅細胞裂解液,充分震蕩搖勻后于室溫環境下避光保存20 min,應用PBS液洗滌2次,以3500 r/min速度,離心10 min后棄上層血清,加入PBS液調整濃度,應用流式細胞儀測定陽性率。(2)腸道菌群分布:采集所有參檢者新鮮糞便樣本0.5 g,按照10倍系列稀釋法對其行稀釋操作,使用培養基培養相對應的腸道菌群。

1.4 觀察指標

(1)分析各組外周血CD14+TLR4+表達陽性率;(2)對比各組腸道菌群分布情況;(3)分析單核細胞表面TLR4表達與腸道菌群分布間的關系;(4)分析TLR4表達與肝癌患者預后的關系。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 各組外周血CD14+TLR4+表達陽性率比較

肝硬化組CD14+TLR4+單核細胞陽性率為(49.25±8.86)%、肝炎組陽性率為(41.93±7.45)%、肝癌組陽性率為(57.68±9.85)%、對照組為(33.74±4.75)%。肝癌組外周血TLR4+單核細胞陽性率最高,與肝炎組、肝硬化組及對照組比較,有統計學差異(P<0.05)。

2.2 各組腸道菌群分布比較及相關性

肝癌組雙歧桿菌、乳酸桿菌菌群分布均少于肝硬化組、肝炎組及對照組,腸球菌及大腸埃希菌菌群分布均多于肝硬化組、肝炎組及對照組,有統計學差異(P<0.05);經Pearson相關性分析顯示,單核細胞表面TLR4表達與雙歧桿菌、乳酸桿菌呈負相關(γ=-0.673、-0.644,P=0.022、0.015);單核細胞表面TLR4表達與大腸埃希菌及腸球菌呈正相關(γ=0.742、0.776,P=0.012、0.007),見表1。

表1 各組腸道菌群分布比較

2.3 TLR4表達與肝癌患者預后

對患者進行隨訪,30例肝癌患者中復發9例,死亡7例。復發及死亡患者外周血中單核細胞陽性率分別高于未復發及存活者,有統計學差異(P<0.05),見表2。

表2 TLR4表達與肝癌患者預后分析

2.4 腸道菌群分布與肝癌患者預后的關系

未復發及死亡患者雙歧桿菌、乳酸桿菌菌群分布均高于復發者及存活者,腸球菌及大腸埃希菌菌群分布少于復發者及存活者,有統計學差異(P<0.05),見表3。

表3 腸道菌群分布與肝癌患者預后的關系

3 討論

正常人體腸道內存在大量、穩定的腸道菌群,但可被培養的僅為400種,且各種腸道菌群代謝產物均經肝臟門靜脈分解及排出,與肝臟共同擔負免疫調節及代謝作用[8-9]。若肝臟出現病變,其代謝內毒素能力減弱,腸道菌群的多樣性減少,而有害菌群及代謝產物量升高,加重肝功能損傷,形成惡性循環。糞便是腸道菌群代謝的主要產物,通過觀察菌群變化可在一定程度上反映腸道菌群狀態,有助于及時調整診療方案,以改善患者病情[10-11]。

TLR家族中共存在10個基因能夠介導機體的免疫功能,其中TLR4包括胞內結構、跨膜結構、胞外結構三個結構域的跨膜蛋白,Toll受體結構域存在于胞內結構中,亮氨酸重復序列存在于胞外結構,能夠特異性識別PAMP及損傷相關分子模式,各指標不斷變化可促使肝臟相關炎癥因子、趨化因子及其他相關介質水平升高,導致肝臟發生病理性改變[12-13]。本研究結果顯示, 肝癌組外周血TLR4+單核細胞陽性率最高,與肝炎組、肝硬化組及對照組比較有統計學差異,肝癌組雙歧桿菌、乳酸桿菌菌群分布均少于肝硬化組、肝炎組及對照組,腸球菌及大腸埃希菌菌群分布均多于肝硬化組、肝炎組及對照組,且單核細胞表面TLR4表達與雙歧桿菌、乳酸桿菌呈負相關(γ=-0.673、-0.644,P=0.022、0.015),與大腸埃希菌及腸球菌呈正相關(γ=0.742、0.776,P=0.012、0.007);復發及死亡患者外周血TLR4+單核細胞陽性率較高,兩組比較有統計學差異,未復發及死亡患者雙歧桿菌、乳酸桿菌菌群分布均高于復發者及存活者,腸球菌及大腸埃希菌菌群分布少于復發者及存活者。其原因在于TLR4與肝癌預后存在密切聯系,且腸道菌群變化在肝癌預后的評估中意義重大,TLR4表達水平越高,雙歧桿菌及乳酸桿菌水平越低,腸球菌及大腸埃希菌水平越高,充分說明TLR與腸道菌群相輔相成,共同影響肝臟結構[14-15]。

綜上所述,TLR4和腸道菌群與原發性肝癌發生及發展存在密切聯系,可為預測患者預后提供參考,據此及時調整治療方案,有助于促進病情轉歸。