龍膽苦苷對非小細胞肺癌細胞A549株化療敏感性的影響分析

劉瀚文 王 旸 楊 崢

非小細胞肺癌是臨床最常見的呼吸系統惡性腫瘤,占全部肺癌80%以上,是我國癌癥相關第一死因,因其起病隱匿,大部分患者確診時已處于中晚期,錯過了最佳手術時機,通常采用化療干預[1]。以鉑類藥物為基礎的二藥聯合是非小細胞肺癌一線化療方案,可顯著減輕腫瘤負擔,延長生存期,改善患者生活質量,但長期使用鉑類藥物會使腫瘤細胞產生耐藥性,嚴重降低治療效率[2]。自噬是細胞的一種程序性死亡機制,可降解細胞器并再利用,研究發現,千金藤通過激活細胞自噬水平可逆轉非小細胞肺癌對埃克替尼的耐藥性[3]。龍膽苦苷是中藥龍膽的主要有效成分,可抗炎、抗菌、保肝、利膽。近年來有研究發現[4],龍膽苦苷可抑制宮頸癌細胞生長、遷移,誘導細胞凋亡及周期停滯,從而發揮其抗癌作用。但目前關于其對癌癥化療耐藥的影響鮮有報道,且缺乏對應機制分析。本研究通過體外培養非小細胞肺癌A549順鉑(cisplatin,DDP)耐藥細胞,觀察龍膽苦苷對A549細胞化療敏感性的影響,并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人非小細胞肺癌耐藥A549/DDP細胞系,購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

龍膽苦苷(純度:99%,上海易恩化學技術有限公司),磷脂酰肌醇3激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路特異性激活劑胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors-1,IGF-1)、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、細胞自噬染色檢測試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司),兔抗人微管相關蛋白1輕鏈3融合蛋白Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3 fusion proteinⅡ,LC3Ⅱ)、p62/SQSTM1、Akt、p-Akt、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p-mTOR一抗(日本MBL株式會社)。

Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司),CKX41倒置熒光顯微鏡(日本Olympus株式會社)。

1.3 細胞培養

取A549/DDP細胞系37 ℃溫水浴解凍,置于RPMI-1640培養基(含0.5 μmol/L DDP、10%胎牛血清)標準條件下(37 ℃,5%CO2)培育,待細胞生長至貼壁,胰酶消化傳代,取對數期細胞作為實驗對象。

1.4 MTT法檢測梯度濃度DDT對A549/DDP細胞增殖抑制率

取對數期A549/DDP細胞,PBS清洗,胰酶消化、重懸,調整細胞密度為1×105個/mL接種至6孔板,各孔加入含不同濃度DDP(終濃度分別為2、4、8、16、32 μg/mL)完全培養液,48 h后加入20 μL MTT溶液(5.00 g/L),2 h后吸棄上清,加入150 μL DMSO,振蕩20 min后靜置,經酶標儀檢測490 nm吸光度值,計算各孔細胞增殖抑制率(%)=(1-各孔吸光度值/對照孔吸光度值)×100%,畫出折線圖計算半數抑制濃度(IC50)。

1.5 細胞分組與處理[5-6]

取對數期A549/DDP細胞,清洗重懸后,以1×106個/mL接種至6孔板,待細胞生長至貼壁,隨機分為對照組、龍膽苦苷組、IGF-1組、聯合組。對照組完全培養基常規培養,龍膽苦苷組培養基加入龍膽苦苷(終濃度40 μmol/L),IGF-1組培養基加入IGF-1(終濃度100 μg/L),聯合組培養基加入龍膽苦苷(40 μmol/L)及IGF-1(100 μg/L)。各組均培養48 h作為后續實驗對象。

1.6 MTT法檢測各組細胞增殖抑制率

取處理后的各組細胞,清洗、重懸、接種、染色同1.3,加入終濃度為16 μg/mL的DDP,培養48 h后,計算各組細胞增殖抑制率(%)=(1-各組細胞吸光度值/對照孔吸光度值)×100%。

1.7 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

取處理后的各組細胞,清洗重懸后,以1×106個/mL接種至6孔板,更換為DDP濃度為10 μg/mL的RPMI-1640培養液,48 h后PBS清洗,冰上離心10 min(3 000 r/min,r=8 cm),binding buffer液標記細胞,混合Annexin V-FITC 5 μL染色,再加入PI 5 μL二次染色,60 min內經流式細胞儀分析細胞凋亡情況,并計算凋亡率。

1.8 MDC染色檢測各組細胞自噬小體

取處理后的各組細胞,清洗重懸后,以1×106個/mL接種至24孔板,12 h后經MDC染色觀察細胞自噬情況,按照試劑盒說明書要求操作后續實驗,各孔均加入MDC自噬體染液400 μL(50 μmol/L)標記細胞,標準條件下孵育1 h,PBS清洗,經倒置熒光顯微鏡觀察記錄,綠色熒光細胞即為自噬陽性細胞,隨機選取5個不重復視野,計算MDC自噬陽性細胞率。

1.9 Western blot法檢測細胞LC3Ⅱ、p62/SQSTM1蛋白表達量

取處理后的各組細胞,PBS清洗,加入RIPA液裂解細胞,低溫離心機離心10 min(8 000 r/min,r=10 cm),經BCA試劑盒定量蛋白。取50 μg樣本蛋白,加入4倍體積上樣緩沖液,100 ℃水浴加熱變性蛋白,離心取上清,恒壓電泳,濕法轉膜,BSA液封閉2 h,加入兔抗人LC3Ⅱ、p62/SQSTM1一抗(1∶500),4 ℃冰箱冷藏過夜,TBST洗膜,加入二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,TBST洗膜,經ECL液發光,暗盒顯影,成像分析儀掃描分析蛋白條帶灰度值,以LC3Ⅱ、p62/SQSTM1條帶灰度值與內參GAPDH的灰度值之比代表目的蛋白相對表達量。

1.10 Western blot法檢測細胞Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達量

取處理后的各組細胞,清洗、裂解、定量、電泳、轉膜、封閉同1.8,加入兔抗人Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR(1:500),4 ℃冰箱冷藏過夜,TBST洗膜,加入二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,TBST洗膜,經ECL液發光,暗盒顯影,成像分析儀掃描分析蛋白條帶灰度值,以Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR條帶灰度值與內參GAPDH的灰度值之比代表目的蛋白相對表達量。

1.11 統計學處理

2 結果

2.1 各濃度DDP對A549/DDP細胞的增殖抑制率

經DDP 2、4、8、16、32 μg/mL處理,A549/DDP細胞的增殖抑制率逐漸升高,IC50在16～32 μg/mL之間,因此后續實驗DDP處理濃度均選用16 μg/mL。見圖1。

圖1 各濃度DDP對A549/DDP細胞的增殖抑制率

2.2 各組增殖抑制率比較

與對照組比較,龍膽苦苷組增殖抑制率升高(P<0.05),IGF-1組增殖抑制率降低(P<0.05);與龍膽苦苷組比較,聯合組增殖抑制率降低(P<0.05);與IGF-1組比較,聯合組增殖抑制率升高(P<0.05),見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率比較

2.3 各組細胞凋亡率比較

與對照組比較,龍膽苦苷組凋亡率升高(P<0.05),IGF-1組凋亡率降低(P<0.05);與龍膽苦苷組比較,聯合組凋亡率降低(P<0.05);與IGF-1組比較,聯合組凋亡率升高(P<0.05),見表2,圖2。

表2 各組細胞凋亡率比較

圖2 細胞凋亡率流式圖

2.4 各組細胞MDC陽性率比較

與對照組比較,龍膽苦苷組MDC陽性率升高(P<0.05),IGF-1組MDC陽性率降低(P<0.05);與龍膽苦苷組比較,聯合組MDC陽性率降低(P<0.05);與IGF-1組比較,聯合組MDC陽性率升高(P<0.05),見表3。

表3 各組細胞MDC陽性率比較

2.5 各組細胞LC3Ⅱ、p62/SQSTM1蛋白表達量比較

與對照組比較,龍膽苦苷組LC3Ⅱ蛋白表達量升高,p62/SQSTM1蛋白表達量降低(P<0.05),IGF-1組LC3Ⅱ蛋白表達量降低,p62/SQSTM1蛋白表達量升高(P<0.05);與龍膽苦苷組比較,聯合組LC3Ⅱ蛋白表達量降低,p62/SQSTM1蛋白表達量升高(P<0.05);與IGF-1組比較,聯合組LC3Ⅱ蛋白表達量升高,p62/SQSTM1蛋白表達量降低(P<0.05),見表4,圖3。

表4 各組細胞LC3Ⅱ、p62/SQSTM1蛋白表達量比較

圖3 細胞LC3Ⅱ、p62/SQSTM1蛋白表達量

2.6 各組細胞p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比較

與對照組比較,龍膽苦苷組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(P<0.05),IGF-1組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR升高(P<0.05);與龍膽苦苷組比較,聯合組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR升高(P<0.05);與IGF-1組比較,聯合組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(P<0.05),見表5,圖4。

表5 各組細胞p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比較

圖4 細胞p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表達量

3 討論

非小細胞肺癌化療耐藥機制復雜多樣,多認為是外排泵相關蛋白過表達、細胞內滅活酶系統異常、促凋亡蛋白低表達、癌細胞DNA自我修復及自噬機制異常等相關,其中癌細胞自噬異常在非小細胞肺癌化療耐藥中的作用被更多人所關注[7]。自噬是真核生物細胞通過溶酶體降解及重新利用自身損傷細胞器的過程,其能力增強可幫助成熟腫瘤細胞抵抗營養不足的不利因素,清除損傷線粒體及失活蛋白,提升腫瘤細胞存活能力,從而促進腫瘤細胞耐藥[8]。尋找腫瘤細胞自噬能力調控藥物或許是未來癌癥藥物開發的新方向,幫助人們克服惡性腫瘤進展及腫瘤耐藥性。

LC3是細胞自噬過程的特異性蛋白,當自噬發生后胞漿型LC3Ⅰ酶解后變為膜型LC3Ⅱ,后者水平升高則表明細胞自噬能力增強[9]。p62/SQSTM1是自噬相關泛素結合蛋白,可與自噬體膜特異結合轉運至溶酶體,其水平升高可代表溶酶體數量減少,細胞自噬活性降低[10]。中醫將非小細胞肺癌歸屬于“積聚”、“肺痿”、“喘癥”等范疇,其主要病機為正氣虧損、陰陽失衡,以致邪毒侵肺、結于胸內、肺氣不宣、津液不布、積聚成痰、痰凝血瘀、脈絡不暢,日久積塊發為積聚,化療乃攻伐之術,屬火熱毒邪,雖消積塊亦傷肝膽,故應以清熱解毒、化瘀通絡為主[11]。中藥龍膽性寒、味苦,歸肝經、膽經,可清熱、瀉肝火、祛邪氣[12]。龍膽苦苷是提取自龍膽的一種環烯醚萜類化合物,可用于肝臟、胃腸道、胰腺等相關疾病治療,發揮其抑制炎癥及氧化應激反應、促進膽汁排出、增強消化能力等功效[13]。井晶等[14]體外細胞實驗顯示,龍膽苦苷與順鉑聯用可破壞人卵巢癌A2780耐藥細胞形態,顯著提升細胞凋亡指數,表現出良好的增殖抑制效果,提示龍膽苦苷或可作為惡性腫瘤化療潛在增敏藥物。本研究結果顯示,與對照組比較,龍膽苦苷組增殖抑制率、凋亡率、MDC陽性率、LC3Ⅱ蛋白表達量升高,p62/SQSTM1蛋白表達量降低,提示龍膽苦苷可有效誘導非小細胞肺癌耐藥細胞自噬,增強其化療敏感性。

PI3K/Akt通路是機體重要信號傳導通路之一,參與腫瘤的發生、發展、轉歸等生理、病理過程,其中PI3K、Akt、mTOR是該通路重要調控蛋白[15]。PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶,是胞外信號與細胞應答的橋梁因子,AKT是PI3K下游重要生長因子調節介質,mTOR是AKT下游靶蛋白,PI3K胞外信號刺激激活后,磷酸化生成PIP2、PIP3等第二信使,激活AKT并將其移位至細胞膜磷酸化,與其他因子共同作用促進mTOR啟動蛋白TORC1轉錄,TORC1持續活化后激活mTOR,促進下游效應因子轉錄,促進腫瘤細胞自噬過程[16]。Dai等[17]研究認為,激活PI3K/Akt信號通路可促進胃癌細胞增殖并抑制DDP誘導細胞凋亡,提示PI3K/Akt通路活性或與癌細胞化療耐藥性呈正相關。本研究結果顯示,與對照組比較,龍膽苦苷組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低,在龍膽苦苷基礎上增用PI3K/Akt信號通路激活劑IGF-1可減弱龍膽苦苷對非小細胞肺癌的化療增敏作用,提示龍膽苦苷可能通過介導該通路誘導非小細胞肺癌耐藥細胞自噬并降低其化療耐藥性。

綜上所述,龍膽苦苷可誘導非小細胞肺癌耐藥細胞自噬并提升其化療敏感性,抑制PI3K/Akt信號通路可能是其作用機制之一。