放射性125I粒子對人肺癌移植瘤小鼠的抑瘤作用及對細胞凋亡的作用研究

趙盼雄 崔 曦 王大勇

肺癌是一種全球范圍內常見的惡性腫瘤,隨著生活環境的惡化,肺癌發病率呈持續上升趨勢,已發展成為世界公共衛生問題[1]。放射性125I粒子是一種人工同位素,通過持續釋放射線殺傷腫瘤細胞,植入125I粒子可有效提高早期小細胞肺癌患者生存率[2-3]。基礎研究發現,125I粒子植入可抑制乳腺癌移植瘤小鼠腫瘤生長[4],另有研究表明,125I放射性粒子可提高人肺鱗癌H520細胞荷瘤鼠移植瘤生長抑制率[5]。本研究通過將人肺腺癌A549細胞植入小鼠背部皮下,并將125I粒子種植于腫瘤內,探討125I粒子對肺腺癌荷瘤鼠腫瘤生長狀況的影響及對癌細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系和動物

肺癌細胞株A549購自美國ATCC細胞庫;健康清潔級BALB/c雄性小鼠30只,8周齡,20～22 g,購自北京北生研生物制品有限公司,許可證號:SYXK(京)2016-0051。

1.2 試劑和儀器

125I購自上海欣科醫藥有限公司;IHC試劑盒、TUNEL試劑盒購自南京建成生物有限公司;兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specificproteinase-3,caspase-3)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)以及GAPDH抗體購自美國Priteintech公司;兔抗人細胞增殖核抗原-67(Ki67)抗體購自美國Abcam公司;電泳儀購自美國賽默飛公司。

1.3 模型制備及實驗分組

3000 r/min離心10 min,收集A549細胞,DMEM培養基將細胞制成密度為1×106個/mL的懸液,將0.5 mL懸液注入小鼠背部皮下,每天用游標卡尺測量腫瘤直徑,達到5 mm即為肺癌小鼠造模成功。

30只小鼠隨機分為模型組、空白對照組以及觀察組,一組10只。6天后,碘伏擦拭腫瘤邊緣,18號植入針從腫瘤邊緣4 mm的位置進入皮下,將針推進至腫瘤內,觀察組小鼠植入125I粒子一枚,空白對照組小鼠植入空白粒子一枚,模型組小鼠僅刺破皮膚,不植入任何粒子,28 d后各組小鼠斷頸處死,進行實驗。

1.4 腫瘤生長情況

分別在植入粒子前和植入粒子第28天,游標卡尺測量腫瘤長徑和短徑,計算腫瘤體積,腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2。植入粒子第28天,各組小鼠斷頸處死后,取出移植瘤,稱重,計算抑瘤率=(模型組腫瘤質量-觀察組腫瘤質量)/模型組腫瘤質量×100%。

1.5 免疫組織化學法檢測ki 67蛋白表達

腫瘤體積和質量測量完成后,取部分腫瘤組織置于4%多聚甲醛中固定,行常規切片,切片厚度為4 μm,經脫水、透明后,滴加3% H2O2于組織切片上,阻斷內源性過氧化物酶活性,胰蛋白酶進行組織抗原修復15 min,3% BSA室溫封閉20 min,滴加ki 67抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜,37 ℃復溫30 min,PBS沖洗,二抗室溫孵育1 h,PBS沖洗,DAB顯色液顯色3 min,蘇木精復染5 min,常規脫水透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察,表達Ki 67的細胞表現為棕黃色,Image Pro Plus 6.0分析Ki 67表達的細胞數,計算增殖指數=Ki 67表達的細胞數/總細胞數×100%。

1.6 HE染色觀察腫瘤組織變化

取腫瘤組織切片,經常規脫水透明后,滴加伊紅染液,染色5 min,雙蒸水將多余染液沖洗干凈,滴加蘇木精染液,染色3 min,雙蒸水沖洗干凈后中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。

1.7 TUNEL染色檢測細胞凋亡

取石蠟切片,經脫水透明后,100 μL蛋白酶K滴加于組織切片上,靜置30 min,50 μL TUNEL溶液滴于組織切片上,避光靜置60 min,終止液反應15 min,50 μL converter-POD滴于組織上,避光靜置30 min,滴加100 μL DAB顯色液于組織上,室溫反應10 min,蘇木精復染,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。細胞凋亡指數(%)=凋亡細胞數/腫瘤細胞總數×100%。

1.8 蛋白印跡法檢測瘤組織中cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量

取100 mg瘤組織,液氮中研磨,RIPA裂解液裂解30 min,4 ℃ 12000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm),吸取上清液,BCA試劑盒測定蛋白濃度,100 ℃煮沸10 min,使蛋白變性。120 v電泳2 h,0.3 A濕轉2 h,室溫封閉1 h,cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2和GAPDH蛋白一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5000)孵育1 h,ECL法顯影,Image J分析條帶灰度值,cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2相對表達量=cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 腫瘤體積和抑瘤率結果

與模型組比較,觀察組腫瘤體積明顯減小(P<0.05);與空白對照組比較,觀察組腫瘤體積減小,抑瘤率升高(P<0.05)。見表1。

表1 腫瘤體積和抑瘤率比較

2.2 HE染色結果

模型組和空白對照組細胞結構完整、呈腫瘤狀細胞形態,無明顯組織壞死,觀察組出現大量壞死細胞、細胞結構被破壞、壞死區周圍細胞間隙增寬且分布不均勻。見圖1。

圖1 腫瘤組織HE染色(×200 A模型組;B空白對照組;C觀察組)

2.3 TUNEL染色結果

與模型組和空白對照組比較,觀察組細胞凋亡指數升高(P<0.05)。見表2,圖2。

圖2 TUNEL染色(×200 A模型組;B空白對照組;C觀察組)

表2 細胞凋亡指數比較

2.4 免疫組化染色結果

與模型組和空白對照組比較,觀察組細胞增殖指數降低(P<0.05)。見表3,圖3。

A為模型組;B為空白對照組;C為觀察組。

表3 增殖指數比較

2.5 蛋白印跡法檢測結果

與模型組和空白對照組比較,觀察組細胞cleaved caspase3和Bax蛋白表達升高,Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05);模型組和空白對照組細胞各蛋白表達比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表4,圖4。

A為模型組;B為空白對照組;C為觀察組。

表4 cleaved caspase3、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量比較

3 討論

肺癌是我國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,由于其惡性程度高,早期診斷困難,多數患者就診時已處于中晚期或已發生轉移,導致手術治療效果欠佳、預后差,患者總體生存率不甚理想[6],尋找有效的治療手段已成為全球亟待解決的難題。

放射性粒子植入是一種新的治療惡性腫瘤的手段,與外放射治療比較,體內近距離植入放射性粒子可靶向對癌細胞產生持續、低劑量放射線,從而提高放療的準確性和持久性。125I粒子由于其低放射、使用安全及副作用小等特點而被廣泛應用腫瘤內植入治療[7]。125I粒子植入腫瘤后,可持續釋放γ射線,處于增殖期的腫瘤細胞對放射線極為敏感,低劑量γ射線會破壞和影響細胞內DNA合成,同時γ射線還會使水分子發生電離,電離產物與細胞內有效成分結合使細胞死亡,從而抑制腫瘤細胞增殖[8]。Ki67是一種細胞增殖特異相關核蛋白,與核糖體RNA轉錄有關,Ki67高表達說明處于增殖期的細胞比例高,G0期細胞比例低,因此Ki67常被視為腫瘤細胞增殖的標志物[9]。研究發現,Ki67可作為預測前列腺癌轉移的有效指標[10]。本研究通過建立人肺癌移植瘤小鼠模型,將125I粒子植入腫瘤內,探討125I粒子的抑瘤作用及對細胞凋亡的影響。實驗結果顯示:125I粒子減小腫瘤體積、提高抑瘤率,此外,破壞細胞結構完整性,使細胞大量壞死、凋亡,同時Ki67蛋白表達升高,提示125I粒子抑制人肺癌移植瘤小鼠腫瘤生長、抑制癌細增殖、促進癌細胞凋亡。

根據細胞死亡原因可將細胞死亡分為生理性死亡及病理性死亡,細胞死亡方式有兩種,即細胞壞死和細胞凋亡。細胞凋亡受到多種基因的精準調控,是一個主動的、程序化的死亡過程,可及時清除機體內受損細胞,在維持機體健康發展和新陳代謝中不可或缺[11]。細胞凋亡受到機體內促凋亡蛋白家族和抗凋亡蛋白家族的協同作用,最主要的兩個家族是Bcl-2家族和caspase家族。Bcl-2家族由兩個核心成員Bcl-2和Bax組成,Bcl-2通過維持細胞內外Ca2+動態平衡,抑制促凋亡蛋白表達及穩定細胞線粒體膜從而發揮抗細胞凋亡作用,Bax是Bcl-2的同源基因蛋白,通過與Bcl-2形成二聚體啟動細胞通路,造成線粒體損傷,誘導細胞凋亡[12]。caspase家族是最重要的促凋亡蛋白家族,當細胞膜上的死亡受體接收到細胞外死亡信號刺激,導致大量細胞色素C釋放至包漿,與caspase9和凋亡酶激活因子1形成凋亡小體,在ATP酶作用下可將caspase9酶切并激活caspase3,進而使無活性的procaspase-3酶原轉變成有活性的cleaved caspase3,從而激活級聯反應,促進細胞凋亡,因此caspase3被認為是細胞凋亡的“執行者”[13]。Luo等[14]研究表明,CpG寡核苷酸上調caspase-3和Bax蛋白表達,抑制Bcl-2蛋白表達誘導膀胱癌細胞凋亡。苦杏仁乙醇提取物通過增加PANC-1胰腺癌細胞中Bax/Bcl-2和caspase3的表達來誘導細胞凋亡[15]。吳立兵等[16]研究表明放射性125I可抑制肺癌移植瘤生長并下調血管生長因子的表達,但是腫瘤生長延緩是否與癌細胞凋亡蛋白相關未見報道,因此本研究采用蛋白印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達情況。本研究結果顯示:放射性125I粒子植入可促進caspase3和Bax蛋白表達,下調Bcl-2蛋白表達,說明125I粒子誘導A549細胞凋亡。

綜上所述,125I可抑制肺癌移植瘤小鼠腫瘤生長,促進癌細胞凋亡,其可能是通過調節凋亡相關蛋白的表達發揮作用,為臨床治療肺癌提供理論依據。