假單胞菌屬中新型IncpGRT1質粒的遺傳特性及其潛在傳播風險

李昕悅,王 鵬,陳方舟,穆小飛,盧秀慧,賀家琪,鄭亞麗,周冬生,殷 喆

假單胞菌屬(Pseudomonas)屬于假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌目(Pseudomonadales),包含200多個亞種[1]。假單胞菌屬菌多為條件致病菌,對人和動物均有致病性,并且有很強的環境適應性。細菌感染及耐藥率的上升,很大程度上與質粒的傳播相關。質粒是細菌染色體外能自主復制的環狀DNA分子,可通過接合在細菌之間進行水平轉移[2]。目前根據質粒不相容性(plasmid incompatibility)對質粒進行分類的方法已經非常普遍[3]。已報道的假單胞菌中的質粒Inc群包括IncP-1至IncP-14、IncpRBL16等[4]。如今可以獲得的假單胞菌中的質粒全序不斷增多,其中很多質粒尚不能歸于現有的Inc群,給假單胞菌中質粒的遺傳特性研究造成很大的困難。該研究采用生物信息學方法,為新的IncpGRT1型別的質粒的保守性及多態性,以及該型別質粒之間的演化關系提供了更深入的見解。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與鑒定菌株15420352分離自湘雅醫院呼吸內科的50歲肺部感染女性患者的尿液樣本。原始菌種記錄為惡臭假單胞菌。本研究對其16S rDNA基因擴增測序進一步確定菌種。

1.2 藥敏試驗使用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析儀對菌株15420352進行藥敏MIC檢測,依據美國臨床與實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2020標準判讀結果。

1.3 質粒測序及組裝對菌株15420352進行三代測序以獲得質粒的完整序列,利用德國Qiagen公司的Ultra Clean? Microbial DNA Isolation kit(CAT.12224-250)試劑盒,提取惡臭假單胞菌15420352的基因組DNA。構建均值約15 kb(片段大小10～20 kb)的DNA文庫,通過PacBio RSII測序儀進行三代測序。同時,構建均值約400 bp左右(片段大小150～600 bp)的雙端測序(paired-end)文庫,通過HiSeq測序儀進行二代測序。利用Proovread軟件通過短的片段校正PacBio長的片段,校正過的PacBio片段通過HGAPv3.0(基因組覆蓋率100×)進行拼接組裝,最終獲得惡臭假單胞菌15420352的完整染色體及質粒序列。

1.4 質粒的生物信息學和比較基因組學分析獲得質粒全序列以后,首先通過RAST2.0(https://rast.nmpdr.org/)初步預測質粒的開放閱讀框(ppen reading frame, ORF),利用Plasmidfinder2.1(https://cge.food.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)確定質粒的復制子基因,在此基礎上,利用Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、ConservedDomains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)等進行每個基因的功能注釋。利用在線數據庫ResFinder(https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/)和CARD(https://card.mcmaster.ca)對耐藥基因進行篩查,ISfinder(https://www-is.biotoul.fr)、INTEGRALL(http://integrall.bio.ua.pt/)和TheTransposonRegistry(https://transposon.lstmed.ac.uk/tn-registry)對質粒的外源插入區結構進行精細注釋。注釋列表完成后,利用Inkscape1.0繪制質粒整體結構圈圖、質粒線性結構比較圖和外源插入區線性結構比較圖。

1.5 序列登錄號進行全基因組測序后,得到質粒p420352-strA序列,提交至GenBank,登錄號為MT074087。

2 結果

2.1 菌種鑒定及藥敏結果測定菌株15420352經16S rDNA擴增初步確定菌種,后將全基因組DNA序列與惡臭假單胞菌參考菌株KT2440(登錄號:NC_002947.4)進行平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)比對分析(http://www.ezbiocloud.net/tools/ani),一般以95%做為判定是否為同一菌種的閾值,ANI值計算結果為96.99%,最終核定該株菌為惡臭假單胞菌。野生株對β-內酰胺類、頭孢類、青霉烯類、喹諾酮類抗生素耐藥,對阿米卡星及四環素類抗生素敏感,見表1。

表1 15420352 MIC測定結果

2.2 IncpGRT1型質粒遺傳特性

2.2.1測序質粒p420352-strA及納入分析的質粒概述 質粒p420352-strA大小為153.6 kb,平均GC含量為56.67%,共預測得到174個開放讀碼框,見圖1。本研究納入分析的質粒共5個,見表2,除上述本研究測序質粒,另有截至2022年9月1日從GenBank中檢索到的4個質粒,包括pGRT1、pZDHY414、pPp1290、pBYT5-2。這5個質粒的復制子(replication)基因與repAIncpGRT1的同源性≥95%。且均包含IncpGRT1型質粒的保守骨架結構。由于不能歸于現有的Inc群,均屬于新的Inc型別IncpGRT1。pGRT1在惡臭假單胞菌DOT-T1E中被發現,因為該質粒為最早測序的該型別質粒,本研究將其作為IncpGRT1型質粒的參考質粒。每個質粒都可分為骨架區和多個獨立的外源插入區,外源插入區分別插入在不同的骨架區位點。

圖1 p420352-strA全序列示意圖最內環表示GC偏移,向外和向內分別表示G和C的相對含量G>C和G

表2 IncpGRT1型別質粒的基本特征

2.2.2IncpGRT1型質粒的骨架區比較分析 IncpGRT1型的5個質粒的骨架區可進一步分為與質粒復制起始相關的區域,維持質粒穩定性相關的區域和接合轉移區,見圖2。這5個質粒>52%的骨架區的同源性>80%。此外,這些質粒的的復制起始區各含有兩個編碼新型復制子的基因,除了上述主復制子repAIncpGRT1,均還含有一個輔復制子,為編碼Rep_3家族復制起始蛋白RepA的repA。IncpGRT1型質粒的保守骨架結構包括:repAIncpGRT1及其iterons(復制區)、parAB(質粒分割區)、dtr2和幾個tra基因(接合轉移區),以及其他調控質粒穩定性相關的基因umuCD、mobD、dnaG等。其中,pBYT5-2與其他四個質粒的骨架區差異最大,orf1260-to-orf390區是其獨有的骨架區結構,長4.2 kb,該區域包括磷酸鹽轉運系統(phosphonate transport system,phnCDE)基因座位和脂多糖轉運酶(LPS export ABC transporter permease,lptGF)基因座位,是菌體內重要的代謝相關基因。此外,pBYT5-2骨架區還發現了mod區,該區有鉬酸鹽轉運蛋白(molybdate ABC transporter,modABE)基因,這些基因均參與調控宿主關鍵的生理功能。p420352-strA和pZDHY414的同源性最強,這兩個質粒的差異只在于p420352-strA的骨架區存在一個orf1344-to-orf990區。

圖2 IncpGRT1質粒序列線性比較圖箭頭表示基因,不同顏色代表不同的基因功能分類;陰影部分表示同源區域(核苷酸相似性>90%)

2.2.3質粒外源插入區 pGRT1的外源插入區包括一個4.7 kb長的srp區和一個ISPa41,見圖3。srp區的兩端發現了Tn4653的殘余,Tn4653為Tn3家族轉座子。該區域內的溶劑外排RND轉運體外膜蛋白(solvent efflux RND transporter outer membrane subunit,srpABCS)基因,可以使菌體在高濃度有機溶劑如甲苯、苯乙烯和二甲苯的環境中具有高耐受能力,甚至生長能力。推測這些與細菌環境適應性相關的外排泵基因由移動元件攜帶并進入菌體中,導致該菌對甲苯的耐性增強。這一區域內還發現有汞轉運(mercuric transcriptional regulator,mer)基因,以及多藥轉運蛋白(escherichia coli multidrug transporter,emrE)基因。因此,質粒攜帶的srp區在提高細菌耐藥性方面也發揮了很大作用。此外該區域另有插入序列ISPpu12、ISPa73、IS1382以及一個IS21家族IS殘余的插入。

圖3 pGRT1 srp區域箭頭指示基因,不同顏色標示不同的基因功能分類

p420352-strA和pZDHY414的外源插入區主要為msr區(圖4)和一個單元轉座子Tn7498(圖5)。

圖4 p420352-strA和pZDHY414的msr區域箭頭表示基因,不同顏色代表不同的基因功能分類;陰影部分表示同源區域(核苷酸同源性>90%);Tn5393c的登錄號為AF262622

在這兩個質粒的msr區中,發現了不完整的Tn6346成分,Tn6346為Tn3家族單元轉座子,由Tn5051的核心轉位模塊tnpA(轉座酶基因)-tnpR(解離酶基因)-res(重組位點)和Tn501的mer區組成,該轉座子在其res位點被打斷為兩部分并發生了顛轉,分別為該區域兩端的Tn6434的5′端片段和3′端片段。Tn5393c被發現插入到該區域中,Tn5393c也是Tn3家族的單元轉座子,其包含兩個鏈霉素類耐藥基因strA和strB。該區域中還發現了肽甲硫氨酸亞砜還原酶(peptide methionine sulfoxide reductase,msrAB)基因,比對結果注釋為毒力因子。其他的移動元件ISPst3、ISPa60和ISPa141也在該區域中被發現。

Tn7498是本研究新發現的一個Tn5053亞家族的單元轉座子,Tn5053為Tn7家族轉座子。最初在黃單胞菌屬W17中被發現,其骨架區核心轉座結構為tniABQR。Tn7498插入到質粒骨架區基因orf588上游的87 bp處,并產生了5 bp的正向重復序列(direct repeats, DRs)。Tn7498未發現其參考元件Tn5053中的mer區。

3 討論

假單胞菌廣泛分布在世界各地的各種環境中,并且質粒在假單胞菌中普遍存在。質粒介導的基因轉移不僅在抗生素耐藥基因的傳播中發揮重要作用,還在微生物降解途徑和毒力因子傳播中發揮重要作用。為探究假單胞菌屬中新型IncpGRT1質粒的遺傳特性,本研究對5個IncpGRT1質粒進行了全面的比較基因組學分析。揭示了該型別質粒介導假單胞菌產生耐藥性和致病性的潛在風險。

目前該類質粒僅被發現在假單胞菌中傳播(搜索截止日期為2022年9月1日),并且這些宿主菌在臨床和環境中均有分布。本研究中的5個質粒有3個來自惡臭假單胞菌,1個來自黃褐假單胞菌,1個來假單胞屬菌。其中,菌株1290分離時間最早,1985年分離自美國的環境樣本[5],據此推測該類質粒最初來自于環境。

通過對IncpGRT1型質粒的比較基因組學分析,更深層次地了解了該型別質粒的保守性以及多樣性。該類質粒基因組均發現了兩個復制子,其中repAIncpGRT1上游發現了8個重復的正向序列iterons,該序列在調控質粒DNA復制中起重要作用。5個質粒包含至少3種主要的外源插入區:srp區域、msr區域以及Tn7498。外源插入區增加了這一類質粒序列的多樣性。復雜的轉座機制是這些外源插入區形成的主要原因。

IncpGRT1型質粒已經成為一些耐藥基因以及毒力基因在假單胞菌屬中積累和傳播的重要載體。在這些質粒的外源插入區中,已經發現了2類已知的抗生素耐藥和汞金屬抗性基因:strAB和mer。在p420352-strA和pZDHY414兩個質粒中,發現了同源性很高的毒力相關的msr區,均編碼兩個毒力基因msrAB,這兩個基因在細菌黏附及侵襲作用中發揮了重要作用[6-7]。一些關鍵的轉運蛋白也在該型別質粒中被發現,pGRT1中包括可以抵抗有機溶劑的外排泵基因srpABCS,根據相關報道攜帶該質粒的惡臭假單胞菌DOT-T1E由于獲得了這類相關基因,其可以在高濃度的甲苯溶液中生存,且耐有機溶劑[8]。該質粒中還發現了emrE基因,許多研究[9-10]已發現在不同攜帶該基因的的菌種中都產生了多種藥物的外排現象。在pBYT5-2的骨架區發現了編碼轉運蛋白的mod、phn、lpt,可以維持宿主的基本生理活動[11- 12]。總之,質粒中這些關鍵的抗性基因和調控基因可以提高宿主在環境壓力下的生存能力。

該研究表明IncpGRT1型質粒在假單胞菌中宿主的廣泛性以及其傳播耐藥及毒力基因的潛力,假單胞菌可以通過傳播這類質粒獲得相關基因。該類型質粒已經在臨床中分離出,推測其在院內環境中有廣泛傳播的潛力,臨床防治過程中需要給予重視。